・６６・ 科技论坛 米诺膦酸水合物片微生物限度检查的方法学验证研究 姜海波 （哈尔滨誉衡药业股份有限公司，黑龙江哈尔滨１５００００） 摘要：目的：建立米诺膦酸水合物片的微生物限度检查方法。方法：按《中国药典））２０１０年版规定进行方法学验证试验。结果：金黄色 葡萄球菌、大肠埃希茵、枯草芽孢杆菌、白色念珠茵、黑曲霉菌的回收率均＞７Ｏ％。结论：采用平皿法进行微生物限度检查，可有效检测米诺 膦酸水合物片中可能存在的微生物。 关键词：米诺膦酸水合物片；微生物限度；验证研究 米诺膦酸是第三代二碳磷酸盐化合物。可有效 地抑制破骨细胞的骨吸收功能，进而使骨代谢循环 减退，从而起到治疗骨质疏松症的疗效。米诺膦酸 水合物片为哈尔滨誉衡药业股份有限公司研制的 新药，按照《中国药典））２ＯＬＯ版微生物限度方法学验 证的规定建立了本品的微生物限度检查方法并进 行方法学验证。 １材料与仪器 １．１供试品：米诺膦酸水合物片，０．１ｇ／片（批 号：１１３０２５、１１０３２９、１１０４０１），哈尔滨誉衡药业股份 有限公司生产。 表１细菌、霉菌及酵母菌检查回收率测定结果表 １．２试验菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、 枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌。 １．３培养基及稀释剂：营养琼脂培养基、玫瑰红 钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、 胆盐乳糖培养基、ＭＵＧ培养基均来自中国药品生 物制品检定所。稀释剂为ｐＨ７．０氯化钠一蛋白胨缓 冲液。 １．４仪器：立式压力蒸汽灭菌器、电热恒温鼓风 干燥箱、电热恒温培养箱、生化培养箱、超净工作 台。 １．５试药：盐酸、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氢氧 化钠。 ２方法与结果 试验次数 试验方法 试验组 阴性菌对照组 ２．１供试液的制备：取三批供试品各１０ｇ，溶于 １００ｍｌ ｐＨ７．０的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液中，混 匀，制成１：１０供试液。 试验组：取１：１０供试液（批号：１１０３２５）１０ｍｌ直接接种于１００ｍｌ ２．２菌液制备：取经３０—３５℃培养ｌ８～２４小时的金黄色葡萄 ｍｌ，３０～ 球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌培养物ｌｍ１分别加入到９ｍ１０．９％ 的胆盐乳糖培养基中，加入已稀释好的大肠埃希菌菌液ｌ取大肠埃希菌菌液ｌｍｌ， 无菌氯化钠溶液中，１０倍依次稀释，金黄色葡萄球菌至１０ ，大肠埃 ３５℃培养１８～２４ｈ观察结果。阳性对照组：加入到胆盐乳糖培养基中，同法试验。阴性对照组：取稀释液替代供 希菌至１０ ，枯草芽孢杆菌至１０ ，约为５０～１００ｅｆｕ／ｍｌ，备用。 方法同试验组，不加菌液。供试品对照组：方法同试验组，不加 取经培养２４ ４８小时的白色念珠菌培养物ｌｍｌ，加入到 试液， ９ｍ１０．９％的无菌氯化钠溶液中，１０倍稀释至１０ ，约为５０～ 菌液。２．５结果 １００ｃｆｕ／ｍｌ，备用。 ２．５．１回收率测定结果。细菌、霉菌及酵母菌检查结果见表１。采 取经培养５ ７天的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，加入 ４ｍｌ含０．０５％（ｍｌ／ｍ１）聚山梨酯８０的０．９％无菌氯化钠溶液将孢子洗 用常规法控制菌检查结果见表２。２．５．２样品检查结果。取三批供试品按确定的方法检查，结果均 脱，转移至另一试管。取ｌｍｌ加入到９ｍｌ含０．０５％（ｍ１］ｍ１）聚山梨酯 ８０的０．９％无菌氯化钠溶液中，１０倍依次稀释至１０ ，约为５Ｏ一 符合规定。３讨论 １００ｅｆｕ／ｍｌ，备用。 方法验证是确认供试品在所采用的检查方法和检验条件下无 ２．３细菌、霉菌及酵母菌检查 取１：１０供试液（批号：１１０３２５）于平皿中，每皿ｌｍｌ，再分别加 抑菌作用，以保证供试品所污染的微生物能被充分检出。根据《中国 ）２ＯＬＯ年版规定，细菌计数、真菌和酵母菌计数方法验证的回 入已制备好的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念 药典）＞７０％。本研究对米诺膦酸水合物片进行了方法验证试验， 珠菌和黑曲霉菌液各ｌｍｌ，每株试验菌平行制备２个平皿。立即倾 收率应ｔ 注营养琼脂培养基约１５—２０ｍｌ，混匀，培养观察结果。回收率测定： 回收率均高于７０％。确定的微生物限度检查法：取本品１０ｇ，溶于１００ｍｌｐＨ７．０无菌 试验组：在加入供试液的同时加入试验菌液ｌｍｌ；菌液组：测定每一 １０供试液。采用平皿法，依 菌株所加的试验菌数：供试品对照组：不加试验菌液，只加供试液， 氯化钠一蛋白胨缓冲液中，混匀，制成１：）２ＯＬＯ年版二部附录ⅪＪ）。 其余操作与试验组相同，测定供试品本底菌数。上述已注入供试品 法检查（《中国药典）的平皿，细菌计数倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置３Ｏ～３５℃培 养３天观察结果。真菌和酵母菌数计数倾注玫瑰红钠琼脂培养基， 待凝固后，置２３—２８＇Ｃ培养５天观察结果。： ２．４控制菌检查