5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105073999 A (43)申请公布日 2015.11.18

(21)申请号 201480017537.7(22)申请日 2014.03.19(30)优先权数据

2013-059431 2013.03.22 JP2013-059432 2013.03.22 JP2014-008197 2014.01.21 JP(85)PCT国际申请进入国家阶段日 2015.09.22

(86)PCT国际申请的申请数据

PCT/JP2014/057500 2014.03.19(87)PCT国际申请的公布数据

WO2014/148539 JA 2014.09.25(83)生物保藏信息

FERMBP-6320 1997.05.08(71)申请人克斯莫石油株式会社

地址日本东京都(72)发明人齐藤优 山本泰嗣 河野榛稀

权利要求书1页 说明书13页

(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限

公司 11227

代理人苗堃 赵曦(51)Int.Cl.

C12P 13/00(2006.01)

(54)发明名称

5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法(57)摘要

本发明提供一种使用产生5-氨基乙酰丙酸的微生物以高收率制造5-氨基乙酰丙酸或其盐的方法。一种5-氨基乙酰丙酸的制造方法，其特征在于，在含有选自L-精氨酸、谷氨酸及它们的盐中的1种或2种以上的培养基中培养产生5-氨基乙酰丙酸的微生物，在5-氨基乙酰丙酸的制造方法中，谷氨酸或其盐的含量以培养基中谷氨酸换算计为42mM～100mM。 C N 1 0 5 0 7 3 9 9 9 A CN 105073999 A

权 利 要 求 书

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1.一种5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法，其特征在于，在含有选自L-精氨酸、谷氨酸及它们的盐中的1种或2种以上的培养基中培养产生5-氨基乙酰丙酸的微生物，谷氨酸或其盐的含量以培养基中谷氨酸换算计为42mM～100mM。

2.根据权利要求1所述的5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法，其中，L-精氨酸或其盐的含量以培养基中L-精氨酸换算计为0.01mM～30mM。

3.根据权利要求1或2所述的5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法，其中，L-精氨酸或其盐的含量以培养基中L-精氨酸换算计为0.5mM～15mM。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法，其中，产生5-氨基乙酰丙酸的微生物属于红细菌属即Rhodobacter属。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法，其中，产生5-氨基乙酰丙酸的微生物为类球红细菌即Rhodobacter sphaeroides或其突变株。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法，其中，产生5-氨基乙酰丙酸的微生物命名为类球红细菌CR-0072009即Rhodobacter sphaeroides CR-0072009，保藏号为FERM BP-6320。

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说 明 书

5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法

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技术领域

[0001]

本发明涉及使用微生物的5-氨基乙酰丙酸或其盐的有效制造方法。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸作为生物合成四吡咯化合物(维他命B12、血红素、叶绿素等)的色素生物合成路径的代谢中间体而广泛存在于生物圈，在生物体内起到重要的作用。5-氨基乙酰丙酸在生物体系中由甘氨酸和琥珀酰辅酶A通过5-氨基乙酰丙酸合成酶而生物合成，或者由谷氨酸经谷氨酰tRNA而生物合成，继5-氨基乙酰丙酸脱水酶之后通过代谢转换为血红素、叶绿素等卟啉化合物。该5-氨基乙酰丙酸的分解性高、对环境无残留性，因此可期待在产业上大量应用(专利文献1、2)。

[0003] 作为使用微生物的5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法，已知有使用各种光合成细菌、特别是属于红细菌属(Rhodobacter)的微生物、其突变株的方法(专利文献3、4)。另外，作为这些微生物的培养条件，已报告有形成限氧条件的方法(专利文献5)、在缓和该限氧条件的条件下使用生产5-氨基乙酰丙酸的突变株的方法(专利文献6)、设定氧条件的方法(专利文献7)等。[0004] 但是，关于培养条件已如上报告，但关于用于生产效率化的培养基、生产促进剂，仅示出了铁含量(专利文献6)，除此以外，没有报告。

[0005] 如上述那样通过微生物培养而生成的5-氨基乙酰丙酸或其盐，通常通过离子交换色谱法、萃取法等常用方法，根据需要进行分离·精制，但作为实现高度精制的方法，有使用阳离子交换树脂从培养液中分离5-氨基乙酰丙酸的方法(专利文献8)。在使用5-氨基乙酰丙酸的阳离子交换树脂的精制中，作为副产物的具有式(1)的结构的5-氨基-4-羟基戊酸会带来影响。即，由于该5-氨基-4-羟基戊酸的pKa值和pI值与5-氨基乙酰丙酸的值非常近，因此在基于离子交换色谱法的精制中，两者竞争离子交换树脂的交换基。因此，为了实现5-氨基乙酰丙酸的高度精制，需要相对于通液的5-氨基乙酰丙酸量而使用大量的离子交换树脂。因此，抑制培养液中的5-氨基-4-羟基戊酸的积蓄量对基于离子交换色谱法的5-氨基乙酰丙酸的高度精制处理的效率化有效。

[0002] [0006]

现有技术文献

[0008] 专利文献

[0009] 专利文献1:日本特开昭61-502814号公报

[0007]

专利文献2:日本特开平2-138201号公报

[0011] 专利文献3:日本特开平6-141875号公报

[0010]

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CN 105073999 A[0012] [0013] [0014] [0015] [0016]

说 明 书

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专利文献4:日本特开平6-153915号公报

专利文献5:日本特开平8-168391号公报专利文献6:日本特开平11-42083号公报专利文献7:日本特开2008-29272号公报专利文献8:日本特开2007-84466号公报

发明内容

这样，虽然对5-氨基乙酰丙酸或其盐的各种制造方法进行研究，但更希望收率得

到进一步提高。

[0018] 本发明的目的在于使用产生5-氨基乙酰丙酸的微生物以高收率制造5-氨基乙酰丙酸或其盐的方法。

[0019] 进一步提供在培养工序中抑制5-氨基-4-羟基戊酸的积蓄的方法。[0020] 在这样的情况下，对产生5-氨基乙酰丙酸的微生物的培养条件、特别是培养基成分反复进行各种研究，结果发现，通过在酵母提取物等通常的营养成分的基础上还含有L-精氨酸、一定量的谷氨酸或其盐的培养基中培养产生5-氨基乙酰丙酸的微生物，从而能够与目前的制造法相比以更高的收率制造5-氨基乙酰丙酸或其盐。[0021] 进而发现，通过在酵母提取物等通常的营养成分的基础上含有L-精氨酸、一定量的谷氨酸或其盐的培养基中培养产生5-氨基乙酰丙酸的微生物，能够抑制5-氨基-4-羟基戊酸的积蓄，从而完成本发明。[0022] 即，本发明提供如下〔1〕～〔6〕的技术方案。[0023] 〔1〕一种5-氨基乙酰丙酸的制造方法，其特征在于，在含有选自L-精氨酸、谷氨酸及它们的盐中的1种或2种以上的培养基中培养产生5-氨基乙酰丙酸的微生物，在5-氨基乙酰丙酸的制造方法中，谷氨酸或其盐的含量以培养基中谷氨酸换算计为42mM～100mM。[0024] 〔2〕根据〔1〕记载的5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法，L-精氨酸或其盐的含量以培养基中L-精氨酸换算计为0.5mM～15mM。[0025] 〔3〕根据〔1〕或〔2〕记载的5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法，L-精氨酸或其盐的含量以培养基中L-精氨酸换算计为0.01mM～30mM。[0026] 〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项记载的5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法，产生5-氨基乙酰丙酸的微生物属于红细菌(Rhodobacter)属。[0027] 〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项记载的5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法，产生5-氨基乙酰丙酸的微生物为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)或其突变株。[0028] 〔6〕根据〔1〕～〔5〕中任一项记载的5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法，产生5-氨基乙酰丙酸的微生物被命名为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)CR-0072009，被保藏号为FERM BP-6320。

[0029] 根据本发明的制造方法，通过在含有L-精氨酸、42mM～100mM的谷氨酸或者它们的盐的培养基中培养产生5-氨基乙酰丙酸的微生物，从而能够以高收率制造5-氨基乙酰丙酸或其盐。

[0017]

进而，通过在含有L-精氨酸、42mM～100mM的谷氨酸或者它们的盐的培养基中培

养产生5-氨基乙酰丙酸的微生物，从而能够不对5-氨基乙酰丙酸或其盐的精制带来影响

[0030]

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说 明 书

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而抑制作为副产物的5-氨基-4-羟基戊酸的积蓄量。

具体实施方式

[0031] 本发明的5-氨基乙酰丙酸或其盐的制造方法，其特征在于，作为培养基，使用含有选自L-精氨酸、谷氨酸以及它们的盐中的1种或2种以上的培养基(使用谷氨酸或其盐时，以谷氨酸换算计为42mM～100mM)。

[0032] 从5-氨基乙酰丙酸的生产率方面和抑制5-氨基-4-羟基戊酸的积蓄的方面考虑，培养基中的L-精氨酸或其盐的含量以L-精氨酸换算计，优选为0.01mM～30mM，更优选为0.1mM～20mM，进一步优选为0.3mM～15mM，最优选为0.5mM～15mM。作为L-精氨酸的盐，可举出盐酸盐等无机酸盐。

[0033] 培养基中的谷氨酸或其盐的含量具有高于以往的培养基中的浓度的特征，从5-氨基乙酰丙酸的生产率方面考虑，以谷氨酸换算计优选为42mM～100mM，更优选为47mM～90mM，进一步优选为48mM～80mM。[0034] 本发明中，谷氨酸换算和L-精氨酸换算是指，在使用这些化合物的盐的情况下、以及使用水合物的情况下，将它们的浓度换算为谷氨酸和L-精氨酸而算出。作为谷氨酸的盐，可举出谷氨酸钠等的谷氨酸碱金属盐等。另外，作为L-精氨酸的盐，可举出L-精氨酸盐酸盐等的精氨酸无机酸盐。

[0035] 本发明的方法中的L-精氨酸、谷氨酸或者它们的盐向培养基中的添加可以在培养基制备时添加，特别是可以与培养基分别进行灭菌处理，在微生物临开始产生5-氨基乙酰丙酸之前添加。这里，作为微生物临开始产生5-氨基乙酰丙酸之前，优选在培养开始后10～45小时，更优选在培养开始后15～40小时，进一步优选在培养开始后20～35小时。[0036] 本发明的方法中使用的产生5-氨基乙酰丙酸的微生物，为原核微生物的光合成细菌，可举出红细菌属(Rhodobacter属)的微生物、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas属)的微生物，优选为红细菌属(Rhodobacter属)的微生物，进一步优选为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)或其突变株，特别优选为被命名为类球红细菌CR-0072009、被保藏号为FERM BP-6320的微生物。

[0037] 本发明中使用的培养基优选含有选自酵母提取物、干燥酵母、蛋白胨、多聚蛋白胨、肉提取物、鱼粉、酪蛋白氨基酸、CSL(玉米浆)以及PDB(马铃薯葡萄糖肉汤，Potato Dextrose Broth)中的1种以上。这些成分中，优选选自酵母提取物和干燥酵母中的1种以上，特别优选为酵母提取物。其含量合计为1g/L以上，更优选的含量为1g/L～20g/L，特别优选为5g/L～10g/L。[0038] 此外，优选用本发明的方法进行培养的培养基含有适量的能够同化的碳源和氮源。作为碳源，可使用葡萄糖等糖类、乙酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸等酸类等。另外，作为氮源，可使用氨、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等氨态氮化合物，硝酸钠、硝酸钾等硝酸态氮化合物等无机氮源、尿素、多聚蛋白胨、酵母提取物等有机态氮化合物等。[0039] 另外，可以在用本发明的方法进行培养的培养基中进一步适当添加丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸等氨基酸等。[0040] 本发明中，在提高5-氨基乙酰丙酸的生产率的方面而优选在培养基中进一步

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说 明 书

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添加无机盐类等的微量成分，特别是将含有磷化合物、锰化合物以及铁化合物的混合物在100℃以上加热或者在0.1MPa以上加压而得的物质。作为磷化合物，含有磷元素即可，优选举出磷酸、磷酸盐、焦磷酸等。更具体而言，可举出磷酸钙(例如，Ca10(PO4)6(OH)2、Ca3(PO4)2)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、焦磷酸、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸铁、磷酸锰，特别优选举出磷酸钙、焦磷酸。[0041] 作为锰化合物，只要含有锰元素即可，优选举出有机营养源所含的锰元素、酸的锰盐、锰的卤化物等，更具体而言，可举出含Mn的酵母提取物、硫酸锰无水合物、硫酸锰五水合物、氯化锰、硝酸锰、碳酸锰、二氧化锰，特别优选举出含Mn的酵母提取物、硫酸锰无水合物、硫酸锰五水合物。[0042] 作为铁化合物，只要含有铁元素即可，优选举出酸的铁盐、铁的卤化物、硫化铁等，更具体而言，可举出EDTA-铁、氯化铁(II)或其水合物、氯化铁(III)或其水合物、硫化铁、柠檬酸铁、硫酸铵铁、乙酸铁、溴化铁、乳酸铁、硝酸铁、硫酸铁、磷酸铁、柠檬酸铁铵、草酸铁、草酸铁铵，特别优选举出氯化铁(II)、氯化铁(III)。[0043] 对于加热或加压的混合物，可以使用介质，作为其介质，可举出实质上不含有培养基成分的液体，优选为水。

[0044] 上述混合物的加热在100℃以上进行，但加热温度优选为110～130℃。另外，上述混合物的加压在0.1MPa以上进行，但加压压力优选设为0.13～0.20MPa。上述混合物优选进行加热且加压。这样的加热和加压需要在混合磷化合物、锰化合物及铁化合物之后进行，在混合前进行的情况下，得不到优异的产生5-氨基乙酰丙酸的微生物的生长促进效果、充分提高5-氨基乙酰丙酸生产能力和氧化酶活性之类的微生物的活性的效果。加热或加压的时间优选为10～30分钟。[0045] 另外，本发明的制造方法中，优选在培养基中添加甘氨酸或乙酰丙酸。甘氨酸的添加量优选在培养基总量中为10～1000mM，特别优选为10～400mM。并且，甘氨酸的每1次添加量优选在培养基总量中为10～200mM，优选添加数次。乙酰丙酸的添加量优选在培养基总量中为0.01～20mM，特别优选为0.1～10mM。由于添加该甘氨酸、乙酰丙酸有时使产生5-氨基乙酰丙酸的微生物的生长速度下降，所以这时可以在生长了一定程度的时刻添加。

[0046] 培养时的培养温度与培养基的pH可以是产生5-氨基乙酰丙酸的微生物生长的条件。例如，培养温度优选为10～40℃，特别优选为20～35℃。培养基的pH优选为4～9，特别优选为5～8。应予说明，培养时pH发生变化的情况下，优选使用氢氧化钠、氨、氢氧化钾等的碱溶液、盐酸、硫酸、磷酸等酸来调整pH。另外，培养时无需特别进行光照射。

[0047] 如上所述得到的培养液中的5-氨基乙酰丙酸或其盐可以利用常法精制。例如，可以通过离子交换色谱法、萃取法等常法根据需要进行分离·精制，但优选通过阳离子交换树脂处理将5-氨基乙酰丙酸大致精制后，在结晶化工序除去杂质的同时，回收高纯度的5-氨基乙酰丙酸或其盐。通过本发明得到的培养液中的5-氨基乙酰丙酸浓度高、另一方面，5-氨基-4-羟基戊酸的积蓄得以抑制，因此容易精制。作为5-氨基乙酰丙酸的盐，可举出盐酸盐、磷酸盐、硝酸盐等。实施例[0049] 以下，举出实施例详细说明本发明，但这些仅以例示的目的列出，本发明并不限定

[0048]

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说 明 书

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于这些实施例。[0050] (制造例1)

[0051] 将200mL培养基1(组成在表1中示出)分注到2L三角烧瓶中，在121℃进行20分钟灭菌后，放置冷却。在其中接种类球红细菌CR0072009(FERM BP-6320)后，在32℃、暗处中振荡培养24小时。[0052] [表1]

[0053]

培养基1

L-谷氨酸钠一水合物Na2HPO4NaH2PO4(NH4)2HPO4MgSO4·7H2OCaCl2·2H2O含Mn的酵母提取物烟酸(+)-生物素硫胺素盐酸盐酵母提取物FeCl3·6H2O葡萄糖

[0054]

浓度(g/L)7.61.730.941.60.40.10610.9×10-32.0×10-32.0×10-52.0×10-33

5.44×10-327

将得到的培养物再次在2L三角烧瓶中制备了200mL的培养基1中以使初始菌体

浓度(OD660nm)为0.2的方式进行接种，在32℃、暗处中振荡培养24小时。[0055] (比较例1)

[0056] 在300mL三角烧瓶中制备了30mL的培养基2(组成在表2示出)中以使初始菌体浓度(OD660nm)成为0.5的方式接种在制造例1中得到的培养物，在28℃、暗处中振荡培养24～26小时。其后，以使甘氨酸成为60mM、乙酰丙酸成为5mM的方式进行添加，用硫酸将pH调整为6.4～6.5之后，向5根20mmφ试验管每次分注5mL。其后，从添加甘氨酸和乙酰丙酸开始18小时后停止培养。培养18小时后的5-氨基乙酰丙酸积蓄量、以及5-氨基-4-羟基戊酸积蓄量在表3中示出。

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培养基2

说 明 书

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[表2]

浓度(g/L)7.61.730.941.60.40.10610.9×10-32.0×10-32.0×10-52.0×10-38

5.44×10-345

L-谷氨酸钠一水合物Na2HPO4NaH2PO4(NH4)2HPO4MgSO4·7H2OCaCl2·2H2O含Mn的酵母提取物烟酸(+)-生物素硫胺素盐酸盐酵母提取物FeCl3·6H2O葡萄糖

[0059]

(实施例1)

[0060] 在28℃培养24～26小时之后，添加L-精氨酸以使其成为0.5mM，除此以外，进行与比较例1同样的操作。将从添加甘氨酸和乙酰丙酸开始18小时之后停止培养时的5-氨基乙酰丙酸积蓄量及5-氨基-4-羟基戊酸积蓄量在表3中示出。[0061] (实施例2)

[0062] 在28℃培养24～26小时之后，添加L-精氨酸以使其成为1mM，除此以外，进行与比较例1同样的操作。将从添加甘氨酸和乙酰丙酸开始18小时之后停止培养时的5-氨基乙酰丙酸积蓄量及5-氨基-4-羟基戊酸积蓄量在表3中示出。[0063] (实施例3)

[0064] 在28℃培养24～26小时之后，添加L-精氨酸以使其成为2mM，除此以外，进行与比较例1同样的操作。将从添加甘氨酸和乙酰丙酸开始18小时之后停止培养时的5-氨基乙酰丙酸积蓄量及5-氨基-4-羟基戊酸积蓄量在表3中示出。

(实施例4)

[0066] 在28℃培养24～26小时之后，添加L-精氨酸以使其成为5mM，除此以外，进行与

[0065]

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说 明 书

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比较例1同样的操作。将从添加甘氨酸和乙酰丙酸开始18小时之后停止培养时的5-氨基乙酰丙酸积蓄量及5-氨基-4-羟基戊酸积蓄量在表3中示出。[0067] (实施例5)

[0068] 在28℃培养24～26小时之后，添加L-精氨酸以使其成为10mM，除此以外，进行与比较例1同样的操作。将从添加甘氨酸和乙酰丙酸开始18小时之后停止培养时的5-氨基乙酰丙酸积蓄量及5-氨基-4-羟基戊酸积蓄量在表3中示出。[0069] [表3]

[0070]

由表3可知，通过添加L-精氨酸使5-氨基乙酰丙酸的生产率提高、并且5-氨基

乙酰丙酸与5-氨基-4-羟基戊酸的积蓄量比的最大提高了约60％。[0072] (制造例2)

[0073] 将200mL的培养基1分注于2L三角烧瓶中，在121℃进行20分钟灭菌之后，放置冷却。在其中接种类球红细菌CR0072009(FERM BP-6320)之后，在32℃、暗处中振荡培养26小时。

[0074] 将得到的培养物再次在2L三角烧瓶中制备了200mL的培养基1中，以使初始菌体浓度(OD660nm)成为0.4的方式进行接种，在32℃、暗处中振荡培养20小时。[0075] (比较例2)

[0076] 在3L容量的培养槽中制备了1.8L的培养基3(组成在表4中示出)中以使初始菌体浓度(OD660nm)成为0.4的方式接种制造例2中得到的培养物，在28℃、通气量1.8L/分使溶存氧浓度的下限值成为5％的方式进行通气搅拌培养。在培养开始24～26小时后以使甘氨酸成为65mM、乙酰丙酸成为5mM的方式进行添加，将搅拌转速设为420rpm，使用硫酸边将pH保持在6.4～6.5边继续培养。进而，从培养开始40小时以后以12小时为单位以使甘氨酸成为65mM的方式添加3次，从最初添加甘氨酸开始52小时停止培养。将5-氨基乙酰丙酸积蓄量在表5中示出。[0077] [表4]

[0071] [0078]

培养基3

浓度(g/L)

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说 明 书

L-谷氨酸钠一水合物Na2HPO4NaH2PO4(NH4)2HPO4MgSO4·7H2OCaCl2·2H2O含Mn的酵母提取物烟酸(+)-生物素硫胺素盐酸盐酵母提取物FeCl3·6H2O葡萄糖

9.31.730.941.60.40.10610.9×10-32.0×10-32.0×10-52.0×10-37.55.44×10-345

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[0079]

(实施例6)

[0080] 在28℃培养24～26小时之后，添加L-精氨酸以使其成为5mM，除此以外，进行与比较例2同样的操作。将5-氨基乙酰丙酸积蓄量在表5中示出。[0081] (实施例7)

[0082] 在28℃培养24～26小时之后，添加L-精氨酸以使其成为7.5mM，除此以外，进行与比较例2同样的操作。将5-氨基乙酰丙酸积蓄量在表5中示出。[0083] (实施例8)

[0084] 在28℃培养24～26小时之后，添加L-精氨酸以使其成为10mM，除此以外，进行与比较例2同样的操作。将5-氨基乙酰丙酸积蓄量在表5中示出。[0085] [表5]

[0086]

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说 明 书

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由表5可知，通过添加L-精氨酸，5-氨基乙酰丙酸的积蓄量得以提高。[0088] (制造例3)

[0089] 将200mL的培养基1分注于2L三角烧瓶中，在121℃进行20分钟灭菌之后，放置冷却。在其中接种类球红细菌CR0072009(FERM BP-6320)之后，在32℃、暗处中振荡培养26小时。

[0090] 将得到的培养物再次在2L三角烧瓶中制备了200mL的培养基1中，以使初始菌体浓度(OD660nm)成为0.4的方式进行接种，在32℃、暗处中振荡培养20小时。[0091] (比较例3)

[0092] 在3L容量的培养槽中制备了1.8L的培养基4(组成在表6中示出)中，以使初始菌体浓度(OD660nm)成为0.4的方式接种制造例3中得到的培养物，在28℃、以通气量1.8L/分使溶存氧浓度的下限值成为5％的方式进行通气搅拌培养。在培养开始24～26小时以后，以使甘氨酸成为65mM、乙酰丙酸成为5mM的方式添加，将搅拌转速设为420rpm，使用硫酸边将pH保持在6.4～6.5边继续培养。进而，在培养开始40小时后和52小时后分别使甘氨酸成为65mM的方式而添加，从最初添加甘氨酸开始40小时后停止培养。将5-氨基乙酰丙酸积蓄量在表7中示出。[0093] [表6]

[0087] [0094]

培养基4

L-谷氨酸钠一水合物Na2HPO4NaH2PO4(NH4)2HPO4MgSO4·7H2OCaCl2·2H2O含Mn的酵母提取物烟酸

浓度(g/L)7.61.730.941.60.40.10610.9×10-32.0×10-311

CN 105073999 A

(+)-生物素

说 明 书

2.0×10-52.0×10-37

5.44×10-345

10/13页

硫胺素盐酸盐酵母提取物FeCl3·6H2O葡萄糖

[0095]

(实施例9)

[0096] 在28℃培养24～26小时之后，添加L-精氨酸以使其成为4.5mM，除此以外，进行与比较例3同样的操作。将5-氨基乙酰丙酸积蓄量在表7中示出。[0097] [表7]

[0098]

由表7可知，通过添加L-精氨酸5-氨基，5-氨基乙酰丙酸的生产率得以提高。

[0100] (制造例4)

[0101] 将200mL的培养基1分注于2L三角烧瓶中，在121℃进行20分钟灭菌之后，放置冷却。在其中接种类球红细菌CR0072009(FERM BP-6320)之后，在32℃、暗处中振荡培养26小时。

[0102] 将得到的培养物再次在2L三角烧瓶中制备了200mL的培养基1中，以使初始菌体浓度(OD660nm)成为0.4的方式进行接种，在32℃、暗处中振荡培养20小时。[0103] (比较例4)

[0104] 在3L容量的培养槽中制备了1.8L的培养基5(组成在表8中示出)中，以使初始菌体浓度(OD660nm)成为0.4的方式接种制造例4中得到的培养物，在28℃，以通气量1.8L/分，使溶存氧浓度的下限值成为5％的方式进行通气搅拌培养。在培养24～26小时后以使甘氨酸成为65mM、乙酰丙酸成为5mM的方式添加，将搅拌转速设为420rpm，使用硫酸边将pH保持在6.4～6.5边继续培养。进而从培养40小时以后，以12小时为单位以成为65mM的方式添加甘氨酸，从最初添加甘氨酸开始52小时停止培养。将培养停止后的5-氨基乙酰丙酸积蓄量在表9中示出。表9的生产比率将比较例4的5-氨基乙酰丙酸积蓄量设为100.0％来表示。[0105] [表8]

[0099] [0106]

培养基5

L-谷氨酸钠一水合物

12

浓度(g/L)7.6

CN 105073999 A

Na2HPO4NaH2PO4(NH4)2HPO4MgSO4·7H2OCaCl2·2H2O

说 明 书

1.730.941.60.40.10610.9×10-32.0×10-32.0×10-52.0×10-37.55.44×10-345

11/13页

含Mn的酵母提取物烟酸(+)-生物素硫胺素盐酸盐酵母提取物FeCl3·6H2O葡萄糖

[0107]

(实施例10)

[0108] 使添加到培养基中的L-谷氨酸钠一水合物的浓度为8.4g/L(L-谷氨酸浓度44.9mM)，除此以外，进行与比较例4同样的操作。从添加甘氨酸开始52小时停止培养时的5-氨基乙酰丙酸积蓄量在表9中示出。[0109] (实施例11)

[0110] 使添加到培养基中的L-谷氨酸钠一水合物的浓度为9.3g/L(L-谷氨酸浓度49.7mM)，除此以外，进行与比较例4同样的操作。从添加甘氨酸开始52小时停止培养时的5-氨基乙酰丙酸积蓄量在表9中示出。[0111] (实施例12)

[0112] 使添加到培养基中的L-谷氨酸钠一水合物的浓度为11.4g/L(L-谷氨酸浓度60.9mM)，除此以外，进行与比较例4同样的操作。从添加甘氨酸开始52小时停止培养时的5-氨基乙酰丙酸积蓄量在表9中示出。[0113] [表9]

[0114]

13

CN 105073999 A[0115]

说 明 书

12/13页

由表9可知，通过增加L-谷氨酸的浓度从而5-氨基乙酰丙酸的生产率得以提高。[0116] (制造例5)

[0117] 将200mL的培养基1分注于2L三角烧瓶中，在121℃进行20分钟灭菌之后，放置冷却。在其中接种类球红细菌CR0072009(FERM BP-6320)之后，在32℃、暗处中振荡培养24小时。

[0118] 将得到的培养物再次在2L三角烧瓶中制备了200mL的培养基1中，以使初始菌体浓度(OD660nm)成为0.2的方式进行接种，在32℃、暗处中振荡培养24小时。[0119] 在300mL三角烧瓶中制备了30mL的培养基2中，以使初始菌体浓度(OD660nm)成为0.5的方式接种得到的培养物，在28℃，暗处中振荡培养24～26小时。其后，以使甘氨酸成为60mM、乙酰丙酸成为5mM的方式进行添加，用硫酸将pH调整为6.4～6.5之后，向5根20φ试验管每次分注5mL。其后，从甘氨酸开始添加18小时后停止培养。另外，添加甘氨酸和乙酰丙酸时，将添加各种氨基酸使其成为5mM的结果在表10中示出。表10的生产比率是将不添加氨基酸的试验系的5-氨基乙酰丙酸积蓄量设为100.0％来表示的。[0120] [表10]

[0121]

添加的氨基酸未添加蛋氨酸赖氨酸苏氨酸鸟氨酸瓜氨酸精氨酸

[0122]

5-氨基乙酰丙酸的产生比率(％)100.095.599.0100.299.898.7106.2

由表9可知，通过增加谷氨酸浓度从而5-氨基乙酰丙酸的生产率得以提高。另外，

由表10可知，添加蛋氨酸、赖氨酸、苏氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸时看不到5-氨基乙酰丙酸的生产率的提高，但添加精氨酸时显示5-氨基乙酰丙酸的生产率提高。[0123] (制造例6)

[0124] 将200mL的培养基1分注于2L三角烧瓶中，在121℃进行20分钟灭菌之后，放置冷却。在其中接种类球红细菌CR0072009(FERM BP-6320)之后，在32℃、暗处中振荡培养26小时。

[0125] 将得到的培养物再次在2L三角烧瓶中制备了200mL的培养基1中，以使初始菌体浓度(OD660nm)成为0.4的方式进行接种，在32℃、暗处中振荡培养20小时。[0126] (比较例5)

[0127] 在3L容量的培养槽中制备了1.8L的培养基5中，以使初始菌体浓度(OD660nm)

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CN 105073999 A

说 明 书

13/13页

成为0.4的方式接种制造例6中得到的培养物，在28℃、以通气量1.8L/分使溶存氧浓度的下限值成为5％的方式进行通气搅拌培养。培养24～26小时后以使甘氨酸成为65mM、乙酰丙酸成为5mM的方式添加，将搅拌转速设为420rpm，使用硫酸边将pH保持在6.4～6.5边继续培养。进而从培养40小时后以12小时为单位以成为65mM的方式添加甘氨酸，从最初添加甘氨酸之后52小时停止培养。将5-氨基乙酰丙酸积蓄量及5-氨基-4-羟基戊酸积蓄量在表11中示出。[0128] (比较例6)

[0129] 添加L-谷氨酸钠一水合物使其成为9.3g/L，除此以外，进行与比较例5同样的操作。将5-氨基乙酰丙酸积蓄量及5-氨基-4-羟基戊酸积蓄量在表11中示出。[0130] (实施例13)

[0131] 在培养24～26小时后，添加L-精氨酸以使其成为5mM，除此以外，进行与比较例6同样的操作。将5-氨基乙酰丙酸积蓄量及5-氨基-4-羟基戊酸积蓄量在表11中示出。[0132] (实施例14)

[0133] 培养24～26小时后，添加L-精氨酸以使其成为7.5mM，除此以外，进行与比较例6同样的操作。将5-氨基乙酰丙酸积蓄量及5-氨基-4-羟基戊酸积蓄量在表11中示出。[0134] (实施例15)

[0135] 培养24～26小时后，添加L-精氨酸以使其成为10mM，除此以外，进行与比较例6同样的操作。将5-氨基乙酰丙酸积蓄量及5-氨基-4-羟基戊酸积蓄量在表11中示出。[0136] [表11]

[0137]

由表11可知，通过添加L-精氨酸从而5-氨基乙酰丙酸的生产率得以提高，进而，

从添加甘氨酸开始52小时后的5-氨基-4-羟基戊酸积蓄量通过添加L-精氨酸而得到抑制，其结果，5-氨基乙酰丙酸/5-氨基-4-羟基戊酸积蓄量比最大提高约50％。

[0138]

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