高效液相色谱实验

请在实验前预习《基础分析化学实验（第二版）》137－140页。 【目的】

(1) 了解高效液相色谱仪的工作原理； (2) 学习评价液相色谱反相柱的方法。 【原理】

高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。它采用高压输液泵和小颗粒的填料，与经典的液相色谱相比，具有很高的柱效和分离能力。色谱柱是色谱仪的心脏，也是需要经常更换和选用的部件，因此，评价色谱柱是十分重要的。而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常。

评价色谱柱的性能参数主要有： （1）柱效（理论塔板数）n

式中tr为测试物的保留时间，W1/2为色谱峰的半峰宽。 （2）容量因子k’

式中t0为死时间，通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间。 (3) 相对保留值（选择因子）α

式中k1’和k2’分别为相邻两峰的容量因子，而且规定峰1的保留时间小于峰2的。 (4) 分离度Rs

Rs2(tr2tr1)/(Wb1Wb2)式中tr1、tr2分别为相邻两峰的保留时间，Wb1、Wb2分别为两峰的底宽。对于高斯峰来讲，Wb=1.70W1/2。

为达到好的分离，我们希望n、α和Rs值尽可能大。一般的分离（如α=1.2，Rs=1.5），需n达到2000。柱压一般为104 kPa 或更小一些。本实验采用多核芳烃作测试物，尿嘧啶为死时间标记物，评价反相色谱柱。 【仪器和试剂】

Waters 510高效液相色谱仪（由Waters 510高压输液泵，Rheodyne 7725i进样器，440检测器和记录仪组成）

色谱柱：5 cm×4.6 mm I.D., YWG-C18H37 (ODS)，10 μm 流动相：甲醇－水(80+20)

－－－

样品I： 含尿嘧啶 (0.010 mg·mL1)、萘 (0.010 mg·mL1)、联苯 (0.010 mg·mL1)、菲

－

（0.006 mg·mL1）的甲醇混合溶液；

样品I I：尿嘧啶的甲醇溶液；萘的甲醇溶液；联苯的甲醇溶液；菲的甲醇溶液。溶液浓度

－

约为0.01mg·mL1； 【实验内容】

（1）准备流动相。将色谱纯甲醇和色谱纯水按比例配制200mL溶液，混合均匀并经超声波

脱气后加入到仪器储液瓶中。

（2）检查电路连接和液路连接正确以后，接通高压泵、检测器和记录仪的电源。设定操作

－

条件为：流速1.0 mL·min1，压力上限2104 kPa (约3000 psi)，检测波长254 nm

－

（该仪器检测波长已固定），灵敏度0.2 AUFS，记录仪走纸速度1.0 cm·min1，记录灵敏度为5 mV。开启记录仪走纸开关记录基线。并调节基线到合适位置（一般为距右10%处）。

（3）待基线平稳后（建议观察检测器的读数显示），将进样阀手柄拨到“Load”的位置，

使用专用的液相色谱微量注射器取5μL样品注入色谱仪进样口，然后将手柄拨到

“Inject”位置，同时按一下检测器的标记按钮，同时计时，记录色谱图。 （4）重复（3）的实验两次。

（5）用同样方法进纯样品的甲醇溶液，确定出峰顺序。

（6）根据三次实验所得结果计算色谱峰的保留时间、半峰宽，然后计算色谱柱参数n、k’，

以及相邻两峰的α、Rs

（7）将流速降为0，待压力降为0后关机。

思考题

1. 高效液相色谱与气相色谱相比有什么相同点和不同点？ 2. 如何保护色谱柱延长使用寿命？

高效液相色谱实验II

固相萃取水样中的多核芳烃并以内标法测定其含量

【目的】

（1）学习固相萃取法处理样品； （2）用内标法定量。 【原理】

固相萃取法是色谱法的一个重要的应用。在此方法中，使一定体积的样品溶液通过装有固体吸附剂的小柱，样品中与吸附剂有强作用的组分被完全吸附；然后，用强洗脱溶剂将被吸附的组分洗脱出来，定容成小体积被测样品溶液。使用固相萃取法，可以使样品中的组分得到浓缩，同时可初步除去对感兴趣组分有干扰的成分，从而提高了分析的灵敏度。固相萃取不仅可用于色谱分析中的样品预处理，而且可用于红外光谱、质谱、核磁共振、紫外和原子吸收等各种分析方法的样品预处理。C18固相萃取小柱具有疏水作用，对非极性的组分有吸附作用，因此可以从水中将多核芳烃萃取出来，完成浓缩样品的作用。固相萃取小柱还有其他类型，如极性、离子交换等。

内标法的原理是，设在V mL样品中含有Wi g待测组分i，加入WS g内标物S，混匀后进样，得组分i及内标物S的峰面积分别为Ai及AS。由于峰面积正比于通过检测器的物质量，所以有：

Wi=fi Ai WS =fS AS

式中fi、fS分别为组分i和内标S的校正因子。

两式相除，得

所以，组分i的体积浓度为：

fi’可用已知被测物i和内标物浓度的样品进样分析得到。内标法是一种相对测量方法，因此，进样量不必准确，操作条件稍有变化对结果没有什么影响。 【仪器和试剂】

Waters 510高效液相色谱仪（由Waters 510高压输液泵，Rheodyne 7725i进样器和440检测器组成）

色谱柱：5 cm×4.6 mm I.D., YWG-C18H37 (ODS)，10 μm

－

流动相：甲醇－水(80+20) 流速：1.0 mL·min1 检测波长：254 nm

C18固相萃取小柱：2支

25 mL移液管：1支 50 mL医用注射器：1支 10 mL医用注射器：2支 2 mL容量瓶：2个

－－

样品I：内标标准样，含萘(0.010 mg·mL1)、联苯(0.010 mg·mL1)、

－

菲（0.006 mg·mL1）的甲醇溶液。

－

样品II：内标物溶液。含联苯（0.10 mg·mL1）的甲醇溶液。 样品III：含萘、菲的被测水样。 【实验内容】

（1）固相萃取小柱预处理：用10 mL注射器将2 mL甲醇压过小柱，再将2 mL纯水压过小

柱。

（2）用移液管取25 mL水样，用50 mL注射器压过小柱，这时水样中的萘和菲被吸附在小

柱上。在小柱下端承接一2 mL的容量瓶，将约1.5 mL甲醇用10 mL注射器压过小柱到容量瓶中，加入一定量内标联苯溶液，定容摇匀，得到浓缩的样品。 （3）按“实验I”中的步骤，进样分析内标标准样和浓缩样品各三次。

（4）取平均结果，计算峰面积As和Ai；根据内标标准样的浓度计算fi’，再计算出浓缩样品

－

中的萘和菲的浓度，进而计算出原水样中的浓度（mg·mL1）。

思考题

1. 内标法与外标法各有哪些特点？ 本实验为什么采用内标法为好？

2. 为什么要对色谱分析中的样品进行预处理？简单列出三个以上的原因。