一种骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105838673 A(43)申请公布日 2016.08.10

(21)申请号 201610398252.3(22)申请日 2016.06.07

(71)申请人 三峡大学仁和医院

地址 443001 湖北省宜昌市伍家岗区夷陵

大道410号(72)发明人 颜洋　汪应瑞　舒龙　王艳　(74)专利代理机构 北京国坤专利代理事务所

(普通合伙) 11491

代理人 姜彦(51)Int.Cl.

C12N 5/0775(2010.01)

权利要求书1页 说明书3页 附图1页

(54)发明名称

一种骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法(57)摘要

本发明公开了一种骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法，于局麻下行骨髓穿刺术；用20毫升干燥无菌注射器两侧共抽取骨髓130毫升注入预先准备好的肝素血袋中，迅速送至实验室；用枸橼酸钠抗凝，加入至干细胞提取专用试剂中，经过干细胞分离提取技术，提取干细胞悬液约0.8ml；将其加入至庆大霉素盐水中稀释至5ml。本发明首先它可以从患者本身骨髓中提取；其次它在体外可以迅速培养扩增，并可以向神经细胞定向分化；而且它们可以回输入患者体内后在宿主中枢神经系统中可以整合并长期存在；它的危险性比异体移植的危险性低，很少涉及到伦理问题，BMSCs在脑卒中的临床治疗方面具有较好的前景及发展潜力。

CN 105838673 ACN 105838673 A

权　利　要　求　书

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1.一种骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法，其特征在于，该骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法包括以下步骤：

于局麻下行骨髓穿刺术；

用干燥无菌注射器两侧共抽取骨髓注入预先准备好的肝素血袋中，迅速送至实验室；用枸橼酸钠抗凝，加入至干细胞提取专用试剂中，经过干细胞分离提取技术，提取干细胞悬液；

将提取后的干细胞悬液加入至庆大霉素盐水中稀释至5ml。2.如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法，其特征在于，用20毫升干燥无菌注射器两侧共抽取骨髓130毫升注入预先准备好的肝素血袋中。

3.如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法，其特征在于，提取干细胞悬液0.8ml。

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说　明　书

一种骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法

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技术领域

[0001]本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法。背景技术

[0002]长期以来，医学界一直认为，神经细胞属于一种永久细胞，缺乏再生能力。因此，传统观点认为：中枢神经系统受损后造成大量神经元缺失时，因不能产生新的神经元，建立新的突触联系，而致损伤后的功能难于恢复。因此，中枢神经系统疾病历来是临床治疗面临的一个世界性的难题。随着科技的进步和医疗技术的发展，人们发现了干细胞在治疗中枢神经系统损伤中的巨大潜能，干细胞的发现改变了以往认为成年哺乳动物中枢神经神经元不能再生的认识，因此干细胞移植成为了当前国际医学界关注的热点，为人类神经疾病的治疗带来了希望。

[0003]骨髓间充质干细胞(MSCs)为中胚层来源细胞，MSCs是一种多潜能干细胞，它对中枢神经系统缺血性、变性性、脱髓鞘性病变造成的神经功能障碍的治疗效果较显著。移植后MSCs迁移至病变的神经组织区域分化成各种类型中枢神经系统细胞。MSCs在基础实验及临床研究中有广大的前景，尤其是在基因治疗，神经系统功能恢复以及造血重建中。[0004]随着社会老龄化的到来，神经系统疾病已经成为导致人类死亡和残废的主要原因之一。在引起人类四大死亡原因的心血管病、肿瘤、脑血管病、和老年变性病中，神经系统疾病占了两个，神经系统疾病具有发病率高、病死率高、致残率高及复发率高的特点，随着干细胞技术在我国不断推广，其应用于中枢神经系统疾病治疗出现许多戏剧化、意想不到的良好的疗效，提高神经系统疾病的治愈率，减少了致残率。干细胞的发现改变了以往认为成年哺乳动物中枢神经神经元不能再生的认识，因此干细胞移植成为了当前国际医学界关注的热点，为人类神经疾病的治疗带来了希望。自体骨髓间充质干细胞移植治疗具有无排异性、安全性和疗效性高的优点。发明内容

[0005]本发明的目的在于提供一种骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法，旨在解决中枢神经系统受损后造成大量神经元缺失时，因不能产生新的神经元，建立新的突触联系，而致损伤后的功能难于恢复的问题。[0006]本发明是这样实现的，一种骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法，该骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法包括以下步骤：[0007]于局麻下行骨髓穿刺术；

[0008]用20毫升干燥无菌注射器两侧共抽取骨髓130毫升注入预先准备好的肝素血袋中，迅速送至实验室；

[0009]用枸橼酸钠抗凝，加入至干细胞提取专用试剂中，经过干细胞分离提取技术，提取干细胞悬液约0.8ml；

[0010]将提取后的干细胞悬液加入至庆大霉素盐水中稀释至5ml。

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说　明　书

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本发明提供的干细胞移植技术单项收费2万元左右，患者有能力承担费用，较其他

干细胞移植不用额外支付异体干细胞的材料费，经济效益更高。

[0012]骨髓间充质干细胞又被称为骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs),是一种混合群体,骨髓间充质干细胞可以分化成为神经系统细胞，其中包括神经元细胞、神经内皮细胞以及神经胶质细胞等。骨髓间充质干细胞较其他类型干细胞比较，它有以下几种优点首先它可以从患者本身骨髓中提取；其次它在体外可以迅速培养扩增，并可以向神经细胞定向分化；而且它们可以回输入患者体内后在宿主中枢神经系统中可以整合并长期存在；且BMSCs具有免疫源性低的特点，所以它的危险性比异体移植的危险性低，很少涉及到伦理问题。综上几种优点，BMSCs在脑卒中的临床治疗方面具有较好的前景及发展潜力。

附图说明

[0013]图1是本发明实施例提供的一种骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法流程图，具体实施方式

[0014]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0015]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。[0016]一种骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法，该骨髓间充质干细胞MSCs提取分离方法包括以下步骤：[0017]S101：于局麻下行骨髓穿刺术；[0018]S102：用20毫升干燥无菌注射器两侧共抽取骨髓130毫升注入预先准备好的肝素血袋中，迅速送至实验室；[0019]S103：用枸橼酸钠抗凝，加入至干细胞提取专用试剂中，经过干细胞分离提取技术，提取干细胞悬液约0.8ml；[0020]S104：将提取后的干细胞悬液加入至庆大霉素盐水中稀释至5ml。[0021]下面结合实施例对本发明进一步说明。[0022]病例入选标准:1.年龄<50岁。2.临床症状及结合影像学资料(头部CT或头部MRI)确诊为中枢神经系统疾病患者。3.持续的神经功能缺损。4.无意识障碍。5.患者及家属同意。6.不伴有癫痫。7.无心、肝、肾和其他脏器严重的功能伤害。完善术前相关检查后，[0023]确定手术方案。于局麻下行骨髓穿刺术，用20毫升干燥无菌注射器两侧共抽取骨髓130毫升注入预先准备好的肝素血袋中，迅速送至实验室，用枸橼酸钠抗凝，加入至干细胞提取专用试剂中，经过干细胞分离提取技术，提取干细胞悬液约0.8ml，将其加入至庆大霉素盐水中稀释至5ml。骨髓穿刺术后严密观察患者各项生命体征。

[0024]术后采用腰椎穿刺蛛网膜下腔注射的方式行自体骨髓间充质干细胞移植治疗。[0025]自体骨髓干细胞移植通过腰椎穿刺注射完成。患者左侧卧位于平板床上，头尽量向胸前屈曲，取屈髋膝位，背部与床面垂直，取3-4腰椎棘突间隙为穿刺点，常规消毒，铺无菌洞巾，以2％利多卡因3ml局部及浸润麻醉至椎间韧带，以9号穿刺针以垂直背部方向自穿

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刺点刺入，刺入约5cm左右后针锋抵抗感消失，缓慢拔出针芯。[0026]待无色透明的脑脊液流出，将BMSCs 5毫升缓慢注入蛛网膜下腔，穿入针芯，拔出穿刺针，胶布固定，嘱患者去枕平卧6小时。[0027]术后应用抗生素6天以防感染，并密切观察病情变化。患者干细胞治疗前双眼失明，右眼仅有光感，双下肢肌力4-级，生活不能自理，治疗后随访患者双眼均有部分视力恢复，双下肢肌力5-级左右，可以行走，生活基本自理，且无任何手术并发症。[0028]本发明操作中关键问题为：1、骨髓的抽取量较大，需要娴熟的骨髓穿刺技术。2、骨髓间充质干细胞的分离，需要高档的骨髓分离设备及良好的试剂。3、腰椎穿刺途径干细胞注入：脑脊液主要是由侧脑室脉络丛分泌出来，其中包含一些生长因子与神经营养因子。[0029]本发明采用的是通过腰椎穿刺途径将BMSCs移植入蛛网膜下腔。与其他途径相比，

并且早期不会对正常通过脑脊液途径可将大量的干细胞汇聚到损伤的病灶区域产生作用，

中枢神经系统产生不利作用。

[0030]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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说　明　书　附　图

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图1

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