标准操作规程(SOP)——病毒空斑测定实验

标准操作规程（SOP）——病毒空斑测定实验

一、目的

测定病毒空斑形成单位（PFU，plaque forming unit），可用于病毒滴度测定及标定病毒的感染能力。本SOP明确了流感病毒空斑形成单位的标准测定方法，保证实验结果的准确可靠。

二、范围

适用于中国国家流感中心的所有技术人员测定流感病毒空斑形成单位。

三、程序

（一）生物安全要求

H5、H7亚型高致病性禽流感病毒及H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行。其余流感病毒的操作需要在BSL-2级实验室中进行。操作人员的生物安全防护要求详见流感中心“生物安全个人防护SOP” （二）材料

1．病毒储存液

2．MDCK细胞和细胞培养液试剂

MDCK细胞：低代数的MDCK细胞（小于25代）， MDCK细胞培养液：D-MEM +5%胎牛血清+抗生素

500mL D-MEM培养液（Gibco, Cat. #11960-051） 5.5mL青、链霉素母液（10000 U/mL 青霉素G； 10000µg/mL 硫酸链霉素，Gibco, Cat. #15140-122）

25.5mL胎牛血清（Gibco Cat. #16000），0.22µm过滤器过滤 EDTA-胰酶（Gibco, Cat. #25300-054）

3．病毒培养液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。

429mL DMEM

66mL 7.5%牛血清白蛋白（BSA） 5mL 100×抗生素

TPCK-胰酶（使用浓度为2mg/mL）

4．其他

平底24，12或6孔微量培养板 红细胞计数器 1.6%低熔点琼脂 无菌PBS液（pH7.2）

中性红溶液（浓度为3.3mg/mL） 5．2×DMEM (Gibco,Cat.# 12100-046) （三）实验步骤

以六孔细胞板为例：

1．第一天，将T75细胞瓶中成片生长的MDCK用EDTA-胰酶消化后计数，

（具体方法见MDCK细胞培养SOP及细胞计数SOP）铺6孔MDCK细胞板，细胞浓度5×105/孔。37ºC 5%CO2孵育24h 。1瓶T75的细胞瓶通常可以分成5块6孔板，备第二天使用。

2．病毒的稀释：用PBS或者D-MEM对病毒储存液行10倍稀释。 3．吸出细胞板上清，用PBS或者无血清的培养基1mL/孔，洗板2~3次。 4．每孔加0.1mL稀释的病毒液于细胞培养板中，每个稀释度要求设置2个平行孔。然后在每孔补加0.5mL病毒培养液。

5．将细胞板置37ºC 5%CO2培养箱，使病毒吸附1h，每20min倾斜摇晃细

胞板一次。

6．吸附1h后，吸去上清。用PBS或者无血清的培养基1mL/孔，洗板1次。 7．微波融化1.6%琼脂后置56℃水浴中，37℃温育2×DMEM液,。 8．混合1.6%琼脂和2×DMEM，使其室温冷却至40℃，加终浓度为0.5~1 µg/mL的TPCK-胰酶，然后将混合液3mL/孔加于6孔板中。

9．将细胞板置于安全柜内直至胶板凝固，颠倒放置于37ºC 5%CO2细胞培养

箱中2~3天。

10．当白色斑点出现后可以用中性红染色。每孔加1mL 用PBS 20倍稀释的

中性红溶液（储存液浓度为3.3mg/mL）37℃作用4h或者过夜。吸去染液后计数空斑。 11．结果判定

举例：

如稀释度是10-6, 空斑平均数为40个，那么结果为 40×106 PFU 0.1 mL-1

10 × 40 × 106 PFU mL-1 = 4×108 PFU mL-1