谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)和谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)活性的测定

谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)和谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)活性的

测定

（一）主要仪器与试剂

1.主要仪器设备

高速离心机, 恒温水浴锅,722G 分光光度计

2.主要试剂

(1)0.05mol/L Tris-HCL缓冲液(pH7.2)：0.2mol/ L 三羟甲基氨基甲烷(24.2g 三羟甲基氨基甲

烷用蒸馏水溶解并定容至 200ml)50ml 和 0.2mol/L HCl 44.2ml , 用蒸馏水稀释至200ml。

(2)0.1mol/L 磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠(AR)11.928g, 磷酸二氢钾(AR)2.176g, 加少量蒸馏水溶解并定容至 1000ml。

(3)2,4-二硝基苯肼溶液：称取 2,4 -二硝基苯肼 19.8mg, 用 10mol/L HCL10ml溶解后,加蒸馏水至100ml , 保存于棕色瓶中备用 , 此液可保存 3 个月 。

(4)0.4mol/L 氢氧化钠溶液：16g 氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至 1000ml。

(5)1mol/L氢氧化钠溶液：40g 氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至 1000ml。

(6)丙酮酸标准液(2μmol/ml)：精确称取纯丙酮酸钠 22.0mg 于 100ml 容量瓶中, 加 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液至刻度。此液应新鲜配制。

(7)GOT 底物液(DL-门冬氨酸 200mmol/L,α-酮戊二酸 2mmol/L)：称取α-酮戊二酸 29.2mg 和 DL-门冬氨酸 2.66g 置于一小烧杯中,加入 1mol/L 氢氧化钠 20.5ml 使溶解,并校正 pH 至 7.4, 然后将溶液移入 100ml容量瓶内, 用 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。

(8)GPT 底物液：(DL-丙氨酸 200mmol/L,α-酮戊二酸 2mmol/L):称取α-酮戊二酸 29.2mg 和 DL-丙氨酸 1.79g置于一小烧杯中, 加入 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.4)约 80ml 煮沸溶解后 ,待冷, 用 1mol/L氢氧化钠调pH 至7.4(约加 0.5ml), 再加0.1mol/L磷酸盐缓冲液至 100ml 混匀,加氯仿数滴防腐, 贮于冰箱内。

(二)操作步骤

1.酶粗制剂的提取 将新鲜植物材料剪碎，取鲜重0.2g左右放入研钵, 加 0.05mol/LTris-HCl 缓冲液(pH7.2) 2.0ml, 在冰浴中研磨 , 得到的匀浆用高速离心机 20000×g 离心 20min，上清液供测酶活度用。

2.谷草转氨酶(GOT)活度测定 取 10ml 试管 2支,一支作测定管, 分别加酶粗制剂 0.1ml 和 GOT 底物液 0.5ml, 另一支作对照管, 仅加酶粗制剂 0.1ml。将二管同时置 37℃水浴,60min 后取出, 各管加 2,4 二硝基苯肼液 0.5ml 终止反应,对照管再加 GOT 底物液0 .5ml。 将二管再置 37℃水浴中 20min, 取出后各管加0 .4mol/ L NaOH 5.0ml ,

混匀 , 10min 后用分光光度计比色, 波长 500nm, 蒸馏水调零点, 读取吸光度。 将测定管吸光度减去对照管吸光度,得吸光度差值, 查工作曲线即可查得丙酮酸体积(ml)。若查得的丙酮酸体积超过 0.2ml时应将酶粗制液稀释后再进行测定, 测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积 V(ml)。

工作曲线绘制：取 10ml 试管 5 支,各管加 0.1mol/ L 磷酸盐缓冲液 0 .1ml，分别加 GOT 底物液 0 .5 、0 .45、0 .40、0 .35 、0.30ml, 丙酮酸标准液 0(对照管)、0 .05、0.10、0.15、0 .20ml。 置 37 ℃水浴 5min, 各管加2 , 4 -二硝基苯肼溶液 0.5ml , 混匀 , 再置 37 ℃水浴中20min, 取出后各管加 0 .4mol/ L 氢氧化钠溶液 5ml, 混匀,10min 后同上比色,读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度,以各管丙酮酸体积为横座标,以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。

3.谷丙转氨酶(GPT)活度测定 取 10ml 试管2支,一支作测定管, 分别加酶粗制剂 0.1ml 和 GPT 底物液 0.5ml, 另一支作对照管, 仅加酶粗制剂 0.1ml。将二管同时置 37℃水浴,30min 后取出, 各管加 2,4-二硝基苯肼液 0.5ml 终止反应,对照管再加 GPT 底物液 0.5ml。将二管再置 37℃水浴中 20min, 取出后各管加 0.4mol/L NaOH 5.0ml, 混匀, 10min 后用分光光度计比色, 波长 500nm, 蒸馏水调零点, 读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度,得吸光度差值, 查工作曲线即可查得丙酮酸体积(ml), 若查得的丙酮酸体积超过 0.2ml时应将酶粗制液稀释后再进行测定,测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积 V(ml)。

工作曲线绘制：取 10ml试管 6 支,各管加 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 0 .1ml , 分别加 GPT 底物液 0.5 、0 .45 、0.40 、0.35、0.30、0 .25ml, 丙酮酸标准液 0(对照管)、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25ml。置 37℃水浴中5min, 各管加 2 , 4-二硝基苯肼溶液 0.5ml, 混匀 , 再置37℃水浴中 20min, 取出后各管加 0 .4mol/ L 氢氧化钠溶液 5ml,混匀,

10min 后同上比色, 读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度,以各管丙酮酸体积为横座标, 以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。

(三)结果计算

转氨酶活度以每克植物鲜样在 30min 内反应生成的丙酮酸微摩尔(μmol)表示。

GOT 活度 ,μmol/ g·30min=(C ×V ×20)/(m ×2)

GPT 活度 ,μmol/ g·30min=(C ×V ×20)/(m ×2)

式中,C—丙酮酸标准溶液的浓度(μmol/ml);

V —由工作曲线查得的丙酮酸体积(ml);

20—稀释倍数;

2 — 反应时间换算系数 , GOT 实际反应时间为 1h, 按习惯本法酶活性以 30min 计算, 故应除以2;

m—植物鲜重(g)。