２００９年１月第６卷第１期 ・药品鉴定・ 高效液相法测定维生素Ｂ２原料药的含量 唐红梅 ，罗文华 ，陈 华’，樊宇戎’，张金莲。 （１．江中药业股份有限公司，江西南昌 ３３０００４；２．江两中医学院，江西南昌 ３３０００４） ［摘要】目的：建立ＨＰＬＣ法测定维生素Ｂ 的含量方法。方法：色谱柱为Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ—Ｃ ８（１５０ ｍｍｘ４．６ ｍｍ，３．５ ｍ）； 流动相为甲醇一０．３５％磷酸的０．０１ ｍｏｌ／Ｌ庚烷磺酸钠溶液（２６：７４）；检测波长２６７ ｎｍ；流速１．０ ｍｌ／ｍｉｎ；柱温３５℃。结果： 维生素Ｂ，在１．５ １２ ｐ￣ｇ／ｍｌ范围内线性关系良好，回归方程为Ｙ＝９４．６１７ ６５Ｘ一０．４６７ ６８（ｒ＝０．９９９ ９５，ｎ＝６），低、中、高ｊ 种浓度的回收率分别为９９．４８％、９９．２６％、１００．５４％，ＲＳＤ分别为０．３７％、０．１８％、０．１８％。结论：该法快速、准确，灵敏度 高，重现性好，可用于维生素Ｂ：的质量控制。 『关键词】维生素Ｂ ；高效液相色谱法；含量测定 【中图分类号】Ｒ９２７．２ ［文献标识码】Ｂ ［文章编号】１６７３—７２１０（２００９）Ｏ１（ａ）一０４５—０３ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ０ｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ２ ｉｎ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ２ ｂｕｌｋ ｄｒｕｇ ｗｉｔｈ ＨＰＬＣ ＴＡ ＮＧ Ｈｏｎｇ－ｍｅｉｌ，ＬＵＯ Ｗｅｎ—Ｈｕａ”，ＣＨＥＮ Ｈｕａｉ．ＦＡＮ Ｙｕ—ｒｏｎｆ．ＺＨＡＮＧ Ｊｉｎ—ｌｉｗｌ２ （１．Ｊｉａｎｇｚｈｏｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．ＬＴＤ．，Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３０００４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｊｉａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３０００４，Ｃｈｉｎａ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ２ ｉｎ ｖｉｔａｍｉｎ ＢＥ ｂｕｌｋ ｄｒｕｇ． Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ—Ｃｌ８（１５０ ｍｉｎｘ４．６ ｍｍ，３．５ ｍ）ｗａｓ ｕｓｅｄ，ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｗａｓ ｍｅｔｈａｎｏｌ一０．３５％ｐｈｏｓ— ｐｈｏｆｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｈｅｐｔａｎｅｓｕｆｆｏｎａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆ２６：７４１ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ １．０ ｍｌ／ｍｉｎ，ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ｓｅｔ ａｔ ２６７ ｎｍ，ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ３５℃．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ａｔ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ １．５—１２ ｒｎｌ ｆｏｒ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ，．Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｗａｓ Ｙ＝９４．６１７ ６５Ｘ一０．４６７ ６８ ｆｒ＝Ｏ．９９９ ９５，ｎ＝６）。Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ２ ｉｎ ｔｈｅ ｌＯＷ。ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ９９．４８％，９９Ｉ２６％ａｎｄ １００．５４％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ＲＳＤ ｗｅｒｅ ０．３７％，０．１８％。０．１８％，ｒｅ— ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｒａｐｉｄ，ａｃｃｕｒａｔｅ，ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｇｏｏｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ，ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ２ ｂｕｌｋ ｄｒｕｇ． 『Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂｚ；ＨＰＬＣ；Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ 维生素Ｂ ，又名核黄素，为水溶性维生素，容易消化和吸 收。其功效为促进发育和细胞的再生，帮助消除口腔内、唇、 流动相为甲醇一０．３５％磷酸的０．０１ ｍｏｌ／Ｌ庚烷磺酸钠溶液 ｆ２６：７４）；检测波长２６７ ｎｍ；流速１．０ ｍｌ／ｍｉｎ；柱温３５℃； 舌的炎症以及增进视力，减轻眼睛的疲劳等。日前维生素Ｂ 的含量测定方法主要为紫外一可见分光光度法ｌｌｌ和荧光分光 光度法。本文用ＨＰＬＣ法测定维生素Ｂ：的含量 叫，并与紫 外一可见分光光度法进行比较，结果表明，ＨＰＬＣ法快速、准 确、灵敏度高、重现性好。 １仪器与试药 １．１仪器 进样量为２０ ｌ，理论塔板数按维生素Ｂ 峰计算，不得少于 ３ ０００。 ２．２溶液的制备 ２．２．１对照品溶液的制备精密量取维生素Ｂ 对照品１５ ｍｇ， 置于１００ ｍｌ棕色容量瓶中，加水适量，水浴加热使完全溶 解，放冷，加水至刻度，摇匀，即得标准贮备溶液；精密量取标 准贮备溶液２ ｍｌ置５０ ｍｌ棕色容量瓶中，加水至刻度。摇匀． 即得标准对照品溶液。 ２．２．２样品溶液的制备 精密量取维生素Ｂ 原料药１５ ｍｇ， 置于１００ ｍｌ棕色容量瓶中，加水适量，水浴加热使完全溶 解，放冷，加水至刻度，摇匀；精密量取２ ｍｌ置５０ ｍｌ棕色容 量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。 Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高效液相色谱仪（四元泵、柱温箱、ＶＷＤ检 测器、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００ Ｔ作站）；ＡＧ２４５电子分析天平；ＵＶ一２４５０ 型紫外一可见分光光度仪。 １．２试药 维生素Ｂ 对照品（中国生物制品检定所，批号：０７１８— ２００００４）；维生素Ｂ：原料药（北京蓝健兴达工贸有限公司提 ２．２．３阴性样品的制备 在不加入维生素Ｂ：原料药的条件 下，按样品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。 ２．３系统适应性试验 供）；甲醇为色谱醇（美国Ｍｅｒｃｋ公司）；水为超纯水，其他试 剂为分析纯。 ２方法与结果 ２．１色谱条件 上述色谱条件下，分别精密量取对照溶液、样品溶液和 阴性溶液各２０ ｌ，注入液相色谱仪，记录色谱图。分析色谱 图可知：对照品、样品中维生素Ｂ：的保留时间基本一致，阴 色谱柱为Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ－Ｃｌ￣（１５ｏ ｍｉｎｘ４．６ ｍｍ，３．５ ｔｘｍ）； 通讯作者 性样品在维生素Ｂ 峰位置处无色谱峰出现。色谱图见图１ ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＨＥＲＡＬＤ巾国医药弓报４５ ・药品鉴定・ ｝ ｎ ！ Ｉ ＆ ＼ Ｃ 图１ ＨＰＬＣ图 （Ａ．对照品；Ｂ．样品；Ｃ．阴性对照品） ２．４线性关系考察 精密量取“２．２．１”项下标准贮备溶液０．５，１．０，２．０，３．０，４．０ ｍｌ， 分别置于５０ ｍｌ棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精密 量取上述两种溶液各２０ ｌ，按上述色谱条件分析，测定峰面 积。结果见表１，图１。 表１线性关系考察结果 浓度（ ） 峰面积 １．４８６ １４１．２ ２．９７２ ２８０．０ ５．９４４ ５５９．０ ８．９１６ ８４７．５ ｌ１．８８８ １ １２２．６ 图２线性回归方程 以维生素Ｂ２峰面积ｙ为纵坐标，溶液浓度Ｘ（ｐ，ｇ／ｍ］）为 ４６巾目墓药弓提ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＨＥＲＡＬＤ ２００９年１月第６卷第１期 横坐标进行绘制标准曲线，计算得回归方程为：ｙ＝９４．６１７ ６５Ｘ一 ０．４６７ ６８（ｒ－＝０．９９９ ９５，ｎ＝６）。结果表明，维生素Ｂ２浓度在１．５～ １２ Ｉｘｇ／ｍｌ范围内。具有良好线性关系。 ２．５精密度试验 精密吸取维生素Ｂ 对照品溶液２０ １，注入液相色谱 仪，连续进样６次，测定峰面积，维生素Ｂ 峰面积的ＲＳＤ为 ０．０８％（ｎ＝６），表明仪器精密度良好，见表２。 表２精密度试验结果 ２．６重复性试验 取维生素Ｂ：（批号０７０６００１）原料，照“２．２．２”项下方法制 备６份样品溶液，分别进样２０ ｌ，测定维生素Ｂｚ含量。平均 含量为９９．３２％，ＲＳＤ为０．３５％（ｎ＝６）。 表３重复性试验 ２．７稳定性试验 取样品溶液，按本文色谱条件，分别于０…２ ４ ６、８ ｈ进 样２０ ｌ测定，维生素Ｂ 峰面积的ＲＳＤ为０．１４％。结果表明， 在避光条件下，维生素Ｂ 在８ ｈ内稳定。 表４稳定性试验（ｎ＝６） ２．８回收率试验 精密称取已知含量（９９．３％）的维生素Ｂ２原料１５ ｍｇ，置 于１００ ｍｌ棕色容量瓶中，加水适量，水浴加热使完全溶解，放 冷，加水至刻度，摇匀；精密量取２ ｍｌ置１００ ｍｌ棕色容量瓶 中。共９份，分别精密加入维生素Ｂ２标准贮备溶液１．２ ｒｎｌ、２ Ｔｎｌ、 ２．８ ｍ１．每个浓度平行３份，按本文色谱条件测定维生素Ｂ 含量．低、中、高３种浓度的回收率和ＲＳＤ分别为：９９．５％、 ９９．３％、１００．５％和０．３７％、０．１８％、０．１８％，结果表明本方法准确 可靠。 ２Ｏ０９年１月第６卷第１期 药品鉴定・ …．Ｉ＿．－Ｉ－－ＩＩ，。ＩＩｌｌ ａ 。。Ｉｔ长各不相同，故在２００～４５０ ｎｍ的波长范围内进行紫外扫描， 结果维生素Ｂ 在２６７ ｎｍ、３７５ ｎｍ与４４４ ｎｍ的波长处均有 吸收．最后确定最大吸收波长２６７ ｎｍ为本法的检测波长。 ３．２流动相的选择 表５加样回收率试验结果 查阅资料中的流动相为甲醇一０．１９％磷酸的０．Ｏ１ ｍｏｌ／Ｌ 庚烷磺酸钠溶液（２６：７４）。试验得知，以此为流动相，采用ＨＰＬＣ 法测定维生素Ｂ 的含量时拖尾较严重，经过多次试验，决定 用甲醇一０．３５％磷酸的０．０１ ｍｏｌ／Ｌ庚烷磺酸钠溶液（２６：７４）为本 法流动相。 【参考文献】 ［１】国家药典委员会．中国药典［Ｓ】．二部．北京：化学工业出版社，２００５．６６５． ［２］Ｗａｎｇ Ｙｕｚｈｕ（￣玉柱），Ｈｕ Ｎａｎ（胡南），Ｌｉｕ Ｑｉｚｈｉ（刘奇志）．Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ２．９样品测定 Ｖｉｔａｍｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｌｅｓｈ ｃｏｌｏｒ Ｖａｒｉ—ｅｔｉｅｓ ｏｆ Ａｐｒｉｃｏｔ（若干杏品 按上述色谱条件分别对２个批号的样品溶液进行检测， 并与药典方法测定的结果进行比较，结果见表６。 表６维生素Ｂ２含量测定结果（ｎ＝３） 种果肉色泽与维生素含量的测定）『ＪＩ．Ｊｏｕｍａｌ ｏｆＦｒｕｉｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ（果树科 学），１９９９，１６（１）：１６—２０． ［３】Ｓｏｎｇ Ｊｉｎｆｅｎｇ（宋劲峰），Ｍｏ Ｌｕｑｉａｎｇ（莫履强），Ｔａｎｇ Ｇｕｏｌｉａｏ（谭国燎）． Ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｖｉｔａｍｉｎｓ ｉｎ Ｍｉｙａｌｉｓａｎｇａｉｅｒ Ｇｒａｎｕｌｅｓ Ａ ｗｉｔｈ Ｉｏｎ—ＲＰ—ＨＰＬＣ ｆ离子对ＨＰＬＣ法测定米雅利桑爱儿Ａ颗粒中３ 种维生素）ｌＪＪ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｏｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（广东 药学院学报），１９９８，ｌ４（３）：１９１—１９２． ［４］Ｌｉｕ Ｘｉａｏｌｉｎ（刘晓琳），Ｗｕ Ｇｕ（武谷），Ｚｈｏｎｇ Ｈｕａｂｉｎ（钟淮滨）．Ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｅ— ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｔｍｉａｎ Ｂｈ Ｂ２，Ｂ６ ａｎｄ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｉｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｖｉｔｍｉａｎ ３讨论 ３．１检测波长的选择 Ｂ Ｌｉｑｕｉｄ ｗｉｔｈ ＨＰＬＣ ｆＨＰＬＣ法测定复合维生素Ｂ溶液中维生素Ｂ 、 维生素Ｂ２、维生素Ｂ６和烟酰胺的含量）【Ｊ】．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｆ－ ｆａｉｒｓ ｆ中国药事１，２００３，１７（４）：２４１—２４２． （收稿１３期：２００８—０８—２９） ２００５年版《中国药典》中维生素Ｂ 的含量测定方法为紫 外法，检测波长为４４４ ｎｍ，查阅的资料中ＨＰＬＣ法的检测波 …一一 ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＨＥＲＡＬＤ巾国医药导报４７