化学发光免疫分析技术及在临床检验中的应用

本科毕业论文

题目： 化学发光免疫分析技术

及在临床检验中的应用

学院： 化学与环境工程学院

班级： 2011级应用化学2班

姓名： 王俊烽

指导教师： 李小花 职称： 讲师

完成日期： 2015 年 05 月 22 日

化学发光免疫分析技术及在临床检验中的应用

摘 要：化学发光免疫分析技术（CLIA）是把免疫反应和化学发光检测方法结合的一种分析技术。其中免疫反应的特异性和灵敏度都很高。CLIA是在酶联免疫分析、放免疫分析和荧光免疫分析后面发展起来的一种检测技术。由于其具有操作简单，标记方便，稳定度和检测灵敏度高，速度快，对环境没有污染等优点因此CLIA在临床上受到医学检验者和医生的一致好评。

关键词：化学发光免疫分析技术；基本原理 ；临床；医学检验

CLIA Technology And Its Application in The Clinical Laboratory

Abstract：Chemiluminescence immunoassay (CLIA) is an analytical technique the immune response and chemiluminescent detection methods combined. Which the immune response is very high specificity and sensitivity. CLIA is the enzyme-linked immunoassay, put immunoassay and fluorescence immunoassay later developed a detection technology. Because of its simple, easy to mark, high stability and sensitivity, speed, no environmental pollution, etc. Therefore CLIA praise medical tests and doctors at the clinic.

Key words :chemiluminescent immunoassay; fundamental; clinical; medical laboratory

目 录

1. CLIA的基本简介 ·················································· 错误！未定义书签。 2. 化学发光免疫分析的原理 ································································· 3

2.1 CLIA原理 ·············································································· 3 2.2器检测原理 ············································································· 3 3 . CLIA的分类 ················································································· 4

3.1发光免疫物质的直接标记分析法 ·················································· 4 3.2化学发光免疫物酶催化分析法 ····················································· 4 3.3发光免疫物的电化学发光分析法(ECUA) ······································· 4 4. 自动化的CLIA分析系统 ································································· 4 5. CLIA技术有关问题探讨 ·································································· 5 6. CLIA在临床检验中的应用 ······························································· 5

6.1可用CLIA来检测分析激素 ························································ 5 6.2 CLIA对类风湿关节炎的检测 ····················································· 6 6.3 CLIA对梅毒的检测 ·································································· 7 6.4 CLIA对艾滋病（AIDS）病毒的检测 ··········································· 7 6.5检测分析肿瘤标志物 ································································· 8 6.6 CLIA对糖尿病的检测 ······························································· 8 6.7 其他物质的检测 ······································································ 8 7. 结 论 ························································································ 9 参考文献 ························································································· 10 致谢 ······························································································· 12

化学发光免疫分析技术及在临床检验中的应用

1 CLIA的基本简介：

目前，CLIA已经获得了越来越多的关注，在不同的领域上面都有应用，包括生命

科学，医学临床诊断，环境检测，食品和药物分析检测等。Arakawe在1975年左右第一个发表了化学发光免疫技术，到目前为止CLIA已经成长为一类优秀的而且成熟的超微量活性物质的测量技术。CLIA是在放射免疫分析的方法上发展来的一类新的技术手段，主要有两类，第一类是免疫反应系统第二类是化学发光系统。免疫反应系统和酶联免疫技术一样，经常使用双抗体夹心法（图1.1）、竞争法（图1.2）、间接法（图1.3）等反应模式。CLIA测量方法是免疫反应中具有高特异性、结合体或测量新的标记免疫分析技术。这种方法的使用范围广，最近十几年成长的特别快，是现在非常优秀的一种对疾病的检测方法，当然这和全世界各个国家的推广还有在免疫分析方法中它的应用频率高有很大关系。在与荧光法和酶免法的对比中CLIA的精准性和灵敏性比前两者都要高出很多倍，可以完全换取酶联免疫分析和放射免疫分析。但是从目前世界上CLIA的发展来看，我们国家的免疫诊断技术还是相对落后的，如表1.1我国和世界强国在免疫的应用上对比。目前市场上面的医院对CLIA的应用很频繁，对CLIA也很重视。现在医院能够操作化学发光免疫分析方法测量激素（黄体生成素、雌二醇、孕酮、睾酮等）；产筛（相关蛋白、β-HCG、AFP）；肿标（CA-125、CA-135、CA-199、CEA、AFP）；乙肝（表面抗原、表面抗体、e抗原、e抗体、核心抗体）；优生（弓形体抗体、风疹病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体I、单纯疱疹病毒抗体Ⅱ、巨细胞病毒抗体）；性病（支原体、衣原体、淋病奈瑟菌）；电解质（钾、钠、氯、总CO2、钙、离子钙）等。CLIA主要具有试剂便宜且有效期长、方法特异性特别好、自动化程度很高、测量的灵敏度高、检测范围广、方法稳定、得到结果的时间很快等一系列优点因此现在各研究人员对这种CLIA技术非常认可。传统的生物检测技术已经逐步的被化学发光免疫技术所取代。

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表 1.1中国与世界其他国家免疫诊断对比

Table 1.1 China and the rest of the world immunodiagnostic contrast

放射免疫 (RIA)

中国 1、在20世纪70年代出现，目前在县级以上的医院使用很平常； 2、此方法在使用频率在下滑；

先进国家 1、在上世纪60年代出现，现在基本在市场上消失了；

2、此方法寿命已经结束；

3、厂家在药品和仪器的开发上是一体的。 3、厂家在药品和仪器的开发上是一体

的。

酶联免疫 (ELISA)

1、在20世纪80年代首次出现，现在在各级的医疗单位都有使用，使我们国家免疫治疗的最普遍的方法； 2、方法处在成熟期；

3、厂家在药品和仪器开发上是一体的。

发光免疫 (CLIA)

1、在上个世纪90年代引进，目前只有极少数较大的医院在一部分项目上面使用； 2、方法处于成长期；

3、全部靠进口，国内没有厂家生产。

1、在上世纪70年代第一次出现，目前仍然继续使用；

2、此方法的寿命基本快结束； 3、厂家在药品和仪器的开发上是一体的。

1、在上世纪80年代出现，目前是各个医院的主要手段； 2、此方法处在成熟期；

3、厂家在药品和仪器的开发上是一体的。

图1.1双抗体夹心法[1] 图1.2 竞争法[1]

Fig1.1 Double antibody sandwich Fig1.2 Competition Law

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图1.3 间接法[1] Fig1.3 Indirect method

2 化学发光免疫分析的原理

2.1 CLIA原理

CLIA的基本原理就是用免疫反应和化学发光反应结合的一种定量检测技术。这种方法具备这两种方法的优点，不仅具有灵敏度高的特点，而且还有特异性高的特点。化学发光免疫分析里面最重要的就是免疫系统和化学发光系统这两种。放射免疫测量和免疫反应里面的抗原还有抗体一样，化学发光却是使用某种化合物经过催化剂还有氧化剂处理出来，在这之后变成激发态的化合物，当它变成基态就可以把剩下的能量转变为光子的状态，最后就可以使用发光测量仪检测这里面光子的产率。即将要被检测的抗原、抗体或在磁性颗粒之间的抗原、抗体在与使用了化学发光剂标记了的抗原、抗体反应。通过磁场和自由状态的组合得出的结果很可靠，优点就是测量的范围广，试剂储存的时间会更加长，自动化程度更加的高，它的灵敏度和RIA等传统测量办法比起来更加的高，得到结果的时间更快，试剂在市场上的价格特别便宜。 2.2 仪器检测原理

在化学反应的检测中，被氧化后的某些化学基团，以形成激发态，并且发射某些波长的光子而返回基态。它实际上就是用一个高灵敏度的组合来分析免疫反应和化学反应的手段，也被叫做微量倍增技术。

CLIA有两个办法，其中的第一个办法就是采用竞争法来测量小分子中间的抗原物质。第二个是抗原物质的大分子通过夹心法测定。其中固相微观磁性粒子直径小，极大地增加了涂层的表面积，抗体或抗原的吸附量，反应速度，并且容易分离和清洗。

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3 CLIA的分类

发光免疫物直接标记分析法、发光免疫物电化学分析法、发光免疫物酶催化化学分析法都是依据运用在免疫分析体系中CLIA不一样的方法而得到。

3.1 CLIA的直接标记分析法

发光物质直接标记免疫物质的这种分析方法就是使用作为抗原物质的吖啶酯直接标记抗体，将适当的测试样品和抗体进行免疫反应，它会形成抗体-包被的固相抗原，吖啶酯标记抗体复合物。

3.2 CLIA的酶催化分析法

发生免疫反应时抗原或者抗体是发光免疫酶催化化学分析方法的样本，发光的酶是这个反应的标记物。

3.3 CLIA的电化学发光分析法(ECUA)

化学发光和电化学是这种分析办法的两个步骤，电子给体是三丙胺（TPA），抗体（抗原）是用三联吡啶钌所标记的。三联吡啶钌是反应的电化学发光剂。因此电子在电场中的转移体现了互相发光反应的特异性。

4自动化的CLIA分析系统：

自动化分析系统就是人们给检测过程中全部使用仪器完成，很少使用人工操作完成的这种仪器的命名，目前国外有许多的厂家已经开发出这种检测仪，并且有多种型号可供选择。原理不一样的化学发光信号，它所检测的数据也有很大差别，因为它产生的信号检测完全不一样，因此也就有了使用不同的试剂盒检测的实验数据不一样。

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表2 不同CLIA的比较

Table 2 Comparison of different methods CLIA

标记物 类型 速度 影响因素 能不能半自动开放

成本 底物

慢 多 能 少 NaOH、H2O2 吖啶酯标记CLIA Apase/HRP

酶标记CLIA 三联吡啶钌

夹心法、竞争法

最快 少 不行 多 金刚烷、鲁米诺

快 少 不行 多 电激光 ECLIA 吖啶酯

5 CLIA技术有关问题探讨

检测方法不同检出的值也有差别：检测结果的影响因素有很多，如有效期、试剂盒质量、仪器的校准、储存的条件、实验室的环境条件等。竞争法与双位点夹心法是最典型的不同反应模式，在统计学上不同的测定值具有不同的意义，因为前者使用的是具有高度特异性的两株单克隆抗体，所以测定值相对于竞争法来说要低。即使反应模式完全相同，由于抗体的亲和力和特异性不同，因此相对于测定值来说也有一定的影响。此外影响测定值的因素还有标记物的活性、固相抗体的制备、标准品的差异等。

6 CLIA在临床检验中的应用

6.1 可用CLIA来检测分析激素

激素是具有高效能的，它是由内分泌细胞或者内分泌腺所分泌的一种生物活性物。细胞之间主要就是依赖这种物质完成信息的传递。对于检测甲状腺激素、性激素等一类的激素，可依据诊断情况和诊断以后恢复情况等数据来提供，测量的特异性和灵敏度从而可以很好的改善。Vutyavanich等[2]使用CLIA测量了血清中含有的催乳素、促卵泡生成素、睾丸素、促黄体生成素，CLIA检测技术能够很好的测量激素的含量。Schmidt-Gaykd等[3]用以前的放射免疫法与测量的降钙素比较后，得出CLIA技术有更高的精密度和准

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确度，能够很好的被临床所使用，使得检测结果更加的准确。 Karlsson等[4]用CLIA技术检测了患有甲状腺病症的病人，这个方法和其他的方法比起来具备更加的准确、快速以及灵敏度高的特点。甲状腺病症有内科诊断和外科诊断。内科诊断有甲亢还有甲状腺的炎症。其中炎症里面又有急性的病症、亚急性的病症和慢性的病症。在内外科的治疗里面区分它们的依据是：在检测的时候内科的甲状腺能力和健康人的有区别，外科检测时它却显示的是和健康人的一样。内科和外科之间却不是完全独立的，它们的病理也是能够彼此变更的，特别是内科某些时候也需求外科的诊断。赵德臣等[5]测定甲状腺激素的具体步骤是采集血样，放在没有放抗凝剂的采血管里面。静置待凝固以后离心，低温保存，样品收集一周左右，所有样品一起测量。CLIA用的仪器是e411。试剂盒用的是和仪器相配套的。测量的是病人血清里面的血清游离三碘甲腺原氨酸、血清游离甲状腺素、促甲状腺激素的含量。完全按照试剂盒的说明，在准备测量的血清里面加入需要的试剂，混合后，在常温环境下静置，把反应条放在荧光仪上面检测读取数据。使用CLIA和其他方法比较起来对患有甲状腺病人的检查，得出的结果是对假阳性的检查效率更好，而在假阴性的检查上面却比其他方法更低。当然CLIA法在检查里面特异性和灵敏度都要比其他方法高出很多。

6.2 CLIA对类风湿关节炎（RA）的检测

RA是人体关节发病，从而导致人体畸形的一类自身免疫系统的慢性病症。RA的发病情况和遗传、感染、性激素都有很大的关联。在上世纪90年代，抗风湿药药品出现在市场上面，对RA的治疗有了很大的改变。2000年Sehellekens[6]用化学试剂合成了环瓜氨酸肽（CCP），其中CCP可以用来作为ELISA反映的吸附试验，在这之后很多研究都研究确定了CCP对于RA的病情治疗有很好的灵敏度和特异性。CCP抗体测量已经能够被用来当成一类全新的判断RA的血清学方法。徐雪亮等[7]使用CLIA 测量了RA患者血清中的CCP，发现CLIA 法测量抗CCP的灵敏度和酶联免疫法比起来要高很多，对RA辨析的灵敏度和特异型也都要高很多。所需要的时间非常少。白伊娜等[8]使用了ECLIA分析和ELISA检测抗环瓜氨酸肽抗体的相同性对比，用上面这两个办法测量抗环瓜氨酸肽抗体的最后实验数据对比得出电化学发光免疫分析和酶联免疫测量抗CCP抗体有非常好的统一性。王慧燕等[9]用CLIA测定抗环瓜氨酸肽抗体有很好的特异性，不过灵敏性仍然还是有点低，这样，可能使有很少的病人病情查不出。因此在医学上最好在检测血清类风湿因子和抗CCP抗体一起进行，这样就可以提高RA的检测率。

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6.3 CLIA对梅毒的检测

马江涛等[10]报道梅毒是一种性传播疾病，它是由苍白螺旋体引起的慢性传染疾病。此病的传染性特别强，而且就目前来看这种病在我们国家的情况是每年都在上升。现在在实验室里面的测量办法主要是甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）和快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）等。侯晓菁等[11]采用了化学发光免疫分析与梅毒螺旋体明胶凝集试验这两个方法，对7913个血清样本进行梅毒螺旋体特异性的测量，对比测量后发现CLIA分析这种抗体的灵敏度比梅毒螺旋体明胶凝集试验高很多，CLIA的阴阳性符合率能够达到99.95%和100%，并且化学发光免疫分析方法简单测试时间快、重复性好，这种方法能够大量的选择梅毒病菌。在医学检测时能够和甲苯胺红不加热血清和RPR一起测量，这样能够测量出很少的假阳性还有钩状效应，最后得到的数据更值得信赖。王华等[12]报道了在使用了CLIA测量的办法后，已经能够得到具备特异性的抗原蛋白，因此，目前对于梅毒的检测可以使用CLIA检测的方法。CLIA在梅毒的检测在医学上处于非常重要的地位。

6.4 CLIA对艾滋病（AIDS）病毒的检测

AIDS是一种获得性免疫缺陷综合征，因为感染艾滋病病毒（HIV）而产生的传染病，到目前为止，世界上除了预防以外再也没有其他的特别有用的诊断方法。隔绝输血的时候以外感染，尽早发现艾滋病病毒感染者，然后使用有效的隔离方法是目前世界上主要的控制方法。在现阶段有很大的研究都确定化学发光免疫分析比酶联免疫灵敏度更好，而且黄疸、溶血及脂血对它的影响非常小，所以假阳性率更少[13]。陈庆如[14]报道ECLIA测定艾滋病病毒的含量使用的方法为：用生物素抗艾滋病病毒抗体, 使用三联吡啶钌标记的艾滋病病毒抗体和即将检测的标本化学作用, 再放入人组织多肽抗原检测试剂, 最后就可以得到标本里面艾滋病病毒的阴阳性临界值。

ECLIA法结合了很多的先进技术很大程度的优化了测量办法的灵敏度, 而且新使用的仪器能够达到测量时候的自动化和标准化, 很大程度的降低了人为操作的误差, 能够给医学检测提供更加准确的数据。电化学发光免疫分析法检测血清中艾滋病病毒的全过程都是在密闭的系统里面进行, 很大程度的减少了病毒的传染和对试剂的污染。数据测量有很好的特异性。精确度比ELISA好很多, 检测的宽度也比ELISA高好几倍。是目前比较好的一种检测方法。 6.5检测分析肿瘤标志物

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肿瘤细胞分裂或生长的时候机体和肿瘤细胞发生化学反应或者有部分肿瘤细胞释放、合成从而生成的一种物质叫做标志物，其中包括癌基因产物、激素、酶（同工酶）及蛋白质等。病人体内组织、体液、血液或细胞中含有肿瘤标志物。化学发光免疫分析可以对病人体内恶性及良性肿瘤细胞实行手术以后的监察和体外的初期病情的判断，当然也能够找到新的肿瘤细胞。Raslan和Shabin[15]比较了两种标志物即健康孕妇和胎膜早破孕妇阴道液中的含量：人绒毛膜促线性激素和甲胎蛋白（AFP），胎膜早破的孕妇与健康孕妇相比阴道积液中的人绒毛膜促线性激素和甲胎蛋白有显著性的增高，其中最高的是甲胎蛋白的特异性和敏感性。Sakaida等[16]测量了肝病患者细胞色素Ｃ的含量，比较得出了色素Ｃ可能会成为肝衰竭的一种全新的标志物。Mao等[17]检测了cyfra21-1的浓度、鳞状细胞癌抗原、血清中癌胚抗原，从而达到了对食管癌患者术后病情监测及诊断的目的。

6.6 CLIA对糖尿病的检测

糖尿病的类别能够分成两种形式的症状：第一种类型是胰岛素依赖型，第二种类型是非依赖型。这两种类型的患者具有不相同的地方就是“三多一少”（平时吃饭吃的比较多、饮水也饮的特别多、随时都想尿、人长的比较瘦）的症状不是特别的明显[18]，最主要的是非依赖型的患者很少能尽早的发现病症，如果不能及时的发行病症并且就医就会对患者造成很大的影响，所以对病人的初期判断和病症的确立就特别关键。对糖尿病患者测量胰岛素原、胰岛素、C 肽是经常使用的几种方法，依靠这些测量的数据能够知道胰岛素合成与分泌功能[19]。谢玮[20]等人对50 例已确诊的非依赖型糖尿病病人进行馒头餐测试，结果显示吃了馒头的病人自己体内的胰岛素虽然比没吃的时候高但还是比正常人低很多。这种情况的原因是胰岛β细胞被高血糖所约束，让它的反应能力降低了。因此在临床上可以通过CLIA测量胰岛素和C 肽的方法来分析判断糖尿病的病情。 6.7 其他物质的检测

CLIA技术还可以进行测定酶、叶酸、细胞因子、维生素、细菌、免疫球蛋白及基因等其他的一些微量物质[21, 22]。

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7 结 论

化学发光免疫分析方法作为一种具有发展前景的免疫分析方法，目前已经表现出来了很多优点，如试剂便宜且有效期长、方法特异性好、自动化程度和测量的灵敏度都很高、检测范围广、方法稳定、得到结果的时间快等。化学发光免疫分析方法目前已被广大的医学工作者和研究者所认可，传统的生物检测技术必将逐步的被化学发光免疫技术所取代。目前应用于临床疾病治疗和诊断中的全自动化学发光免疫分析仪器能进行全自动分析，对检测者不但无害，而且试剂稳定，速度快，可以得出准确的结果。展望未来，CLIA技术本身一定会不断改进与完善，朝着更快速、精准、灵敏度高和智能化的方向进步。随着我们国家高新精密仪器制造业技术的发展和进步。小型的，更加智能化的化学发光免疫分析仪器在微型自动化的化学发光免疫分析系统研制上将取得更大的进步。CLIA必将会为临床诊断提供非常重要的依据。化学发光免疫分析技术在未来的应用上必将迎来全新的高峰。

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致 谢

在本次论文的撰写中，我得到了导师李小花老师的精心指导，不管是从开始定方向还是在查资料准备的过程中，一直都耐心地给予我指导和意见，使我在总结学业及撰写论文方面都有了较大提高;花费了李老师很多的宝贵时间和精力，同时也显示了老师高度的敬业精神和责任感。导师严谨的治学态度，开拓进取的精神和高度的责任心都将使我受益终生!在此，我对李老师表示诚挚的感谢以及真心的祝福。

四年大学生活即将结束，回顾几年的历程，老师们给了我们很多指导和帮助。他们严谨的治学，优良的作风和敬业的态度，为我们树立了为人师表的典范。在此，我对所有的化学与环境工程学院的所有老师表示感谢，祝你们身体健康，工作顺利!

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