维普资讯 http://www.cqvip.com １９０ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ，Ｓｅｐ．２００７，Ｖｏ１．１４，Ｎｏ．３ 丙型肝炎病毒不同分型方法的分析及分型意义 周君霞，梁 宁 （海１２市人民医院检验中心，海南海１２ ５７０２０８） 关键词：丙型肝类病毒；基因分型；血清学分型；疫苗 中图分类号：Ｒ５７５．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—１７０３（２００７）０３—０１９０—０２ 丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）是经血液传播的一种高 对５ ＮＣＲ区进行分型。型特异性引物扩增法较 度异质性单股正链ＲＮＡ病毒，基因序列为：５ ＤＮＡ序列分型简单、快速、经济，但对各型的引物 ＮＣＲ一（、＿Ｅ１一Ｅ２／ＮＳ１一ＮＳ２一ＮＳ３一ＮＳ４一ＮＳ５—３ ＮＣＲ，现 设计要求高，要保证各型之间有较大差异。 已证实ＨＣＶ基因组各部位的变异程度不一致，５ １．３ 型特异性探针杂交法 根据各型ＨＣＶ 非编码区（５ ＮＣＲ）最为保守，在编码基因中核心区 基因组的序列差异，合成型特异性探针与ＰＣＲ产 （Ｃ区）有着高度遗传保守性，非结构（ＮＳ）区基因 物杂交后进行分型，所设计的探针要求保证各型或 次之，编码包膜蛋白的Ｅ２／ＮＳ１区可变区最高。许 各亚型间有较大的差异。常用的探针来自５ ＮＣＲ 多学者分析了世界各地不同分离株ＨＣＶ基因序 和ＮＳ５区，如庄辉等［３ 人用ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡＴＭ（线性 列，发现分离株间核苷酸及氨基酸同源性有较大的 探针）ＨＣＶ １１分型试剂盒对ＨＣＶ基因分型，根据 差异。但是由于没有ＨＣＶ体外培养系统，许多传 ５＂ＮＣＲ区设计了２０个型特异性寡核苷酸探针，这 统的病毒学分类方法无法应用，ＨＣＶ的分类将不 些探针被转移至硝酸纤维膜上和５ ＮＣＲ区有生物 可避免的几乎全部依赖于各株之间全基因组序列 素标记的扩增产物反向杂交，结果用生物素一亲和 比较或某一片段的序列比较。以下对ＨＣＶ不同 素显色系统（ＢＡＳ）判断，根据条带位置确定ＨＣＶ 的分型方法、原理及分型的意义作一概述。 的基因型和亚型。这种方法可以分辨６种基因型 １ ＨＣＶ基因分型 和相关的亚型，由于需要的探针多，较为繁琐。 １．１核苷酸序列分析法 核苷酸序列分析是 １．４限制性片段长度多态性分析法（ＲＦＬＰ） ＨＣＶ分型中最经典、可靠的方法。最初的分类是 根据不同ＨＣＶ型别的某一区段个别碱基的变 基于全序列比较的基础上，通过对全长９．４ｋｂ核 异会直接导致某些酶切位点的改变，将扩增后的 苷酸序列的分析，了解其同源性程度，后来发展到 ＰＣＲ基因产物用不同的限制酶酶切后，不同型 利用部分基因组序列进行比较分析，通过ＰＣＲ扩 ＨＣＶ或亚型ＨＣＶ将得到不同片段的酶切产物， 增有代表性的基因片段如５＂ＮＣＲ、Ｃ、ＮＳ５Ｂ，再进行 并以此对ＨＣＶ分型。一般选５ ＮＣＲ和ＮＳ５保守 核苷酸序列测定。许多其他的分型方法都将此方 区作为ＲＦＬＰ分型的靶基因。Ｄａｖｉｄｓｏｎ等［４ 扩增 法作为参考标准，但该技术要求高、耗时多、成本 了５ ＮＣＲ ２５１ｂｐ的基因片段，用Ｈａｅ ＩｌＩ—Ｒｓａ Ｉ、 高，难以在临床工作上使用。 Ｈｉｎｆｌ—Ｍｖａ Ｉ、ＢｓｔＵ １酶切，得到不同的ＲＦＬＰ酶 １．２ 型特异性引物扩增法 根据核苷酸片段 切图谱。他们用此方法检测了欧、美、非、亚１５个 某区域内序列变异的特点，设计一系列型特异性引 国家７２３个供血者血样，发现了几种不常见的基因 物进行扩增，不同的型可扩增出长短不一的片段进 型分布，为研究ＨＣＶ流行传播提供了资料。 行分型。这种方法主要应用于Ｃ区和ＮＣ区。 Ｏｋａｍａｔｏ等［ 根据Ｃ区核酸序列的差异设计了１ ＲＦＬＰ分型法具有正确、快速、经济等优点，但需改 对公用引物和４对分型引物，对Ｃ区基因用ＰＣＲ 进，以便于能区分ＨＣＶ越来越多的变异。 扩增，根据扩增片段的大小将ＨＣＶ分为Ｉ～Ⅳ １．５ 系统进化树分析法 １９９３年Ｓｉｍｍｏｎｄｓ 型。许可等ｌ２ 也根据５ ＮＣＲ区序列型特异性引物 等ｌ５ 提出了系统进化树分析法，他们对ＮＳ５Ｂ区经 ＰＣＲ扩增的２２２ｂｐ片段进行进化树结构分析，按 照发现的先后主要分为６个型别，每一型别有２～ 收稿日期：２００６—１卜０９；修回日期：２００７—０２—０１ ３个亚型，先后将ＨＣＶ分成６个型和１１个亚型。 维普资讯 http://www.cqvip.com 标记免疫分析与临床２００７年９月第１４卷第３期 另外还可把Ｃ、５＂ＮＣＲ、Ｅ１作为靶序列分型，该方法 不仅协调了各种分型方法，还可进行新基因型及亚 型命名。Ｌｕ等Ｌ６ 最近对中国９个地区１４８例样本 进行Ｃ区、Ｅ１区、ＮＳ５Ｂ区测序和进化树分析，分 型结果显示，在珠江三角洲地区６ａ型已取代２ａ型 成为该地区流行程度仅次于１ｂ型的基因型，昆明 地区则除１ｂ型外，呈现包括２ａ、３ａ、３ｂ、６ａ等的多 基因型分布状况。此外，在昆明和广州还检出６型 新的亚型（６ｖ），这说明６型可在中国南部地区检 出，并不仅限于香港和澳门地区。西南地区则呈现 １ｂ型为主，２ａ、３ａ、３ｂ、６ａ等多种基因型分布的特点。 以往分型认为确定新的基因型主要分两步：一 是根据核苷酸的同源性，进行初步分型，如针对 ＮＳ５的同源性小于７２ ，则可判定为新的ＨＣＶ 型，而同源性在７５ ～８６ 之间，则可认为是一个 新的亚型。二是通过将新序列与已知序列作遗传 进化树分析，以证实初步分型的准确性。然而，根 据核苷酸的同源性进行基因分型，结果常常是不可 靠的。２００５年新达成的ＨＣＶ基因型命名规则共 识＿７ 认为，基因型间的多样化日益明显，因此很难 确定亚型和同源性的界值，简单的同源性分析不能 够作为分型的方法。检测ＨＣＶ基因型最准确的 方法就是对基因组的某个区进行ＰＣＲ扩增、测序 及进化树分析，选择的区有ＮＳ５、Ｃｏｒｅ、Ｅ１和５ ＮＣＲ。目前ＨＣＶ可分为６个基因型及不同亚型， 以阿拉伯数字表示ＨＣＶ基因型，以小写的英文字 母表示基因的亚型（如ｌａ、２ｂ、３ｃ等）。在ＨＣＶ分 型中应采用何种方法，主要取决于实验室的现有条 件以及分型的目的。如果需要区分所有亚型，或者 鉴别新亚型的存在，那么就必须进行测序以及进化 树分析。而临床工作中，常只需将１型与其他基因 型区别开来，以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林 的剂量，这时上述的任何一种方法均可以采用。 ２ ＨＣＶ血清学分型 ＨＣＶ血清学分型方法与传统的病毒学分型不 同，它是基于基因分型的基础上，对不同型别的核 苷酸及氨基酸序列进行分析，找出具有抗原性且具 有型特异性的区段，用人工方法合成相应的肽段或 制备重组抗原进行分型。安文锋等［８ 采用Ｃ区型 特异性多肽（Ｃ区第６５～８ｌ位）为捕获抗原进行 ＨＣＶ分型试验，其结果与ＲＦＬＰ分型结果的符合 率达９３．１８ 。陈志等 ］采用了Ｃ区及ＮＳ４区两 个含免疫表位的型特异性片段用于分型，血清分型 １９１ 阳性率为７２．９ ；Ｃ区和ＮＳ４区阳性率分别为 ３７．５ 和５４．２ 。徐皖苏等［１ 用ＭＵＲＥＸ ＨＣＶ １－６血清分型试剂与ＲＦＬＰ的基因分型作了比较， 符合率为９７．６ 。 血清学分型方法对实验条件及技术要求低，对 于保存不当、ＲＮＡ降解的血清，都不失为一种合适 的方法，而且可对大量样品进行分析。如在检测 ＨＣＶ传播途径或某一地区流行的型别时，如果用 基于ＰＣＲ的分析方法，则费时费力，且不易操作， 若用血清学分型方法则快速简便，样品用量少，在 常规实验室就可操作。不足之处是结果准确性比 基因分型要差一些，灵敏度不够高，不同型之间发 生交叉反应可导致分型错误，且到目前为止，用血 清分型的方法还不能分出亚型。 ３ ＨＣＶ分型的意义 ＨＣＶ基因型有地区差异，不同基因型与病情 进展、肝癌发生及干扰素疗效有关，对散发性丙型 肝炎的传播途径和疫苗研制等均有重要意义。 （１）ＨＣＶ基因型分布存在明显的地区差异，其 中美国、德国、法国主要以Ｉ／ｌａ型感染为主，欧洲 常见的基因型为Ｉ／ｌａ、Ⅱ／ｌｂ、Ⅲ／２ａ、Ⅳ／２ｂ和少 量的Ｖ／３ａ型，日本以Ⅱ／ｌｂ型为主，而中东、南非 和香港地区常见的基因亚型分别为４ａ，５ａ和６ａ 型，澳门地区仅发现Ⅱ／ｌｂ及６ａ两种基因型。至 ２００５年１２月７日，ＧｅｎＢａｎｋ数据库中中国内地地 区共提交ＨＣＶ序列６４４例，其中６ａ型有６２例，３ａ 型１８例，３ｂ型５５例，大多为来自华南，西南等地 的样本。这些数据表明在华南，西南等靠近东南亚 的地区，基因型分布与中国内地其他地区有着显著 的不同。 （２）不同基因型与感染的严重程度有关。众多 报道认为ＨＣＶ ｌｂ型与慢性肝炎重症化、肝硬化和 肝细胞癌有密切关系。 （３）基因型与干扰素疗效有关。由于１型和４ 型对于聚乙二醇干扰素联合利巴韦林标准化治疗 较２型和３型更为耐药，因此ＨＣＶ基因型检测在 临床上具有重要意义。２００４年《丙型肝炎防治指 南》一文ｕ 指出，ＨＣＶ ＲＮＡ基因分型有助于判定 治疗的难易程度及制定抗病毒治疗的个体化方案。 （４）通过基因型的比较和分析，有助于了解各地 区、不同人种ＨＣＶ的流行分布及遗传变异趋势，为 ＨＣＶ诊断、治疗和疫苗的研制提供理论依据。 （下转第１９６页） 维普资讯 http://www.cqvip.com １９６ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ，Ｓｅｐ．２００７，Ｖｏ１．１ ４，Ｎｏ．３ ［１８３ Ｋａｚｍｉｅｒｃｚａｋ Ｓ Ｃ，Ｓｅｋｈｏｎ Ｈ，Ｒｉｃｈａｒｄｓ Ｃ．Ｆａｌｓｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｒｏ— ｐｏｎｉｎ Ｉ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ａｂｂｏｔｔ ＡｘＳＹＭ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｄ ｔｏ ｆｉｂｒｉｎ ｓｉｎｇ ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，２０００，４６（４）：４４３— ４４４． ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，２００５， １０１：２７－３１． Ｅｚｚ３ Ａｐｐｌｅ Ｆ Ｓ，Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｍ Ｍ．Ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ ａｎｄ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉ— ｎａｓｅ ＭＢ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎ－ｈｏｓｐｉｔａｌ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｒｅｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ［１９］Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｓ，Ｈａｌｅｎｉｕｓ Ｈ，Ｐｕｌｋｋｉ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒ— ｅｎｃｅ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｂｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｒｏｐｏ— ＥＪ３．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，２００５，５１（２）：４６０—４６３． Ｅ２３３ Ｒｏｏｎｇｓｒｉｔｏｎｇ Ｃ，Ｗａｒｒａｉｃｈ Ｉ，Ｂｒａｄｌｅｙ Ｃ．Ｃｏｍｍｏｎ ｃａｕｓｅｓ ｏｆ ｔｒｏｐｏｎｉｎ ｅｌｅｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃ－ ｎｉｎ ａｕｔ０ａｎｔ｜ｂ０ｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，２００５，５１（５）：８３９—８４７． ［２０３ Ｔａｎａｋａ Ｈ，Ａｂｅ Ｓ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｒｕｍ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃａｒｄｉ— ａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ ａｎｄ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ ｉｎ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔ ｔｉｏｎ：ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ［Ｊ］．Ｃｈｅｓｔ，２００４，１２５： １８７７－１８８４． ｓｉｚｅ ｓｏｏｎ ａｆｔｅｒ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎＥＪ３．Ｃｏｒｏｎ Ａｒｔｅｒｙ Ｄｉｓ，１９９７，８： ４３３—４３９． （张增武编辑） ［２１］Ｒａｖｋｉｌｄｅ Ｊ．Ｒｉｓｋ ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｕ— （上接第１９１页） ｂｕｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ：ｒｅｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｔｙｐｅ ｌ ｈ ｉｓｏ— 参考文献： ［１３ Ｏｋａｍａｔｏ Ｈ，Ｋｏｊｉｍａ Ｍ，Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｎｕｃｌｅ— ｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｆｒｏｍ ａｎ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａｎ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｉｖｅｒ ｌａｔｅｓ ａｎｄ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｎｅｗ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ６ ｖａｒｉａｎｔｓ［－Ｊ３．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒ— ｏｌ，２００５，７５：５３８—５４９． ［７１ Ｓｉｍｍｏｎｄｓ Ｐ，Ｂｕｋｈ Ｊ，Ｃｏｍｂｅｒ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｐｒｏｐｏｓａｌｓ ｆｏｒ ａ ｕｎｉｆｉｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｄｉｓｅａｓｅ ＥＪ３．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，１９９４：７５：６２９—６３５． Ｅ２３许可，邓小昭，丁伟良，等．江苏省宜兴地区丙型肝炎病毒基因 分型研究ＥＪ３．中华流行病学杂志，２００５，２６：９０１—９０３． ［３］庄辉，Ｔｒａｃｙ Ｌ，崔怡辉，等．我国部分地区丙型肝炎病毒基因分 型研究ＥＪ３．中华流行病学杂志，２００１，２２：９９—１０１． ［４３ Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｆ，Ｓｉｍｍｏｎｄｓ Ｐ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｊ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｒｖｅｒ ｏｆ ｍａ— ｊｏｒ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｕｓｉｎｇ ＲＦＩ Ｐ ｏｆ ｌ－Ｊ３．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００５．４２：９６２—９７３． Ｅ８３安文锋，朱万孚，王淑芹，等．丙型肝炎病毒血清学分型与基因 分型研究ｌ－Ｊ３．中华微生物学和免疫学杂志，１９９７，１７（２）：８８— ９１． ［９３陈志，王宇，陈红松，等．用合成寡肽的酶免疫法检测丙型肝炎 病毒血清型ＥＪ３．中华微生物学和免疫学杂志，１９９８，１８（２）： ｌ６２－ｌ６４． ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ５ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，１９９５，７６：１１９７－１２０４． ［１Ｏ３徐皖苏，王磊，耿大影，等．Ｍｕｒｅｘ丙型肝炎病毒血清分型试 剂应用及其评价ＥＪ３．国外医学：临床生物化学与检验学分册， ２００５，２６（７）：４７３—４７５． ［５３ Ｓｉｍｍｏｎｄｓ Ｐ，Ｈｏｌｍｅｓ Ｅ Ｃ，Ｃｈａ Ｔ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｏ ｓｉｘ ｍａｊｏｒ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｓｕｂ— ［１１］中华医学会传染病与寄生虫病分会和肝病分会．丙型肝炎防 治指南ＥＪ３．中华肝脏病杂志，２００４，１２（４）：１９４—１９８． ｔｙｐｅｓ ｂｙ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＳ５ ｒｅｇｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，１９９３，７４：２３９ｌ一２３９９． （李 宁、陈泮藻编辑） ［６］Ｉ ｕ Ｌ，Ｎａｋａｎｏ Ｔ，Ｈｅ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｄｉｓｔｒｉ—