第5讲 酶的生物合成法生产

酶可由动物（如胰蛋白酶、胃蛋白酶）、植物（如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶）和微生物（细菌、霉菌、酵母）产生，其中工业酶制剂大多数由微生物发酵法生产。

由于微生物世代时间短，繁殖快、容易培养和管理，可大规模工业化生产，所以工业酶制剂大多由微生物发酵产生。 产酶微生物的获得：

1、从有关菌种保藏机构购买 2、从自然界分离筛选

国内一些比较著名的菌种保藏机构

ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 ISF 中国农业科学院土壤肥料研究所 CAF 中国林业科学院菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心 YM 云南省微生物研究所

GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 CCTCC 中国典型培养物保藏中心 ，武汉大学 HKUCC 香港大学保藏中心，香港大学

台湾新竹BCRC (Bioresources Collection and Research Center)台湾生物资源保存及研究中心（食品工业发展研究所）

国外一些比较著名的菌种保藏机构

ATCC (American Type Culture Collection)

NRRL(Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业部菌种保藏中心。 DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)

NBRC (NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心，NBRC（IFO）是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。 JCM (Japan Collection of Microorganisms)

VKM (All-Russian Collection of Microorganisms)

CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures荷兰真菌中心收藏所) UKNCC (United Kingdom National Culture Collection)

NCIMB (National Collections of Industrial, food and Marine Bacteria)英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心

2、从自然界中分离筛选产酶微生物

从与产生目的酶菌种可能相适应的生态环境中，采样分离筛选。

1克土壤中含有1×108个微生物，自然界蕴藏着巨大的微生物资源。

从不可培养微生物中筛选新酶种。用PCR技术从土样中直接扩增DNA，能够从不可培养的

微生物中分离到DNA，并用作克隆来源，可获得更多种类的酶。 从极端环境微生物筛选新酶种

嗜热微生物（Thermophiles 60-85 ℃， 超嗜热菌生长温度85℃以上,105 ℃）。 嗜冷微生物（Psychrophiles -10～0 ℃ ） 嗜盐微生物(Halophiles, 含盐32%或5.2%) 嗜酸微生物(Acidophiles,pH2.5)

嗜碱微生物(Alkalophiles, pH11)

嗜压微生物(Barophiles，1.01×105Pa,4 ×107Pa)

重视微生物资源、基因文库、基因表达载体等方面的建设，以及极端环境微生物，不可分离

微生物，绝对厌氧微生物等新的种质资源的研究开发。

产酶微生物的分离筛选方法

1)样品的采集：从富含该酶作用底物的场所采集样品。 2)富集培养: 投其所好，取其所抗。

3)分离获得纯培养(pure culture)的微生物。 4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。

5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。

培养基

细菌：营养肉汤琼脂培养基（pH 7.0，30-37℃） 霉菌：可用察氏、土豆（PDA）、麦汁琼脂培养基（pH5.5， 25-28℃，为了防止霉菌菌落蔓延连成一片，可加入0.1%去氧胆酸钠、0.1%山梨糖等限制菌落扩散）。 放线菌：高氏培养基、甘油精氨酸培养基等（pH6.8-7.0）。 酵母：用麦汁琼脂培养基（pH4.5-5.5）。

添加药物抑制非目标微生物生长

 为了提高菌种分离效率，分离培养基中可添加一定数量的药剂以抑制干扰微生物的生长。 如为了抑制霉菌的生长，可加入30-50U/ml 制霉菌素、克念霉素、杀霉素等多烯类抗生素，不妨碍细菌的生长繁殖。

为了抑制细菌的生长，可添加青霉素（30U/ml）、四环素、猛加拉红（0.001%），不干扰霉菌的生长。

为了抑制酵母的生长，可添加放线菌酮（50mg/ml）或纳他霉素，不影响细菌的生长。 选择性培养基

用酸性或碱性培养基，可分离耐酸、耐碱微生物； 用添加了高浓度食盐培养基，可分离耐盐微生物；

用添加了高浓度盐或蔗糖的培养基，可分离耐高渗透压的微生物； 在高温下培养，可筛选耐热、耐高温微生物；

分离芽孢杆菌，可先将样品于80℃加热10-15min，可杀死不产芽孢微生物后，再进行分离。

为了提高工作效率，可设计一些肉眼可检测的方法，可设计一些肉眼可检测的方法，如水解透明圈、变色圈等方法，鉴别出产酶菌落。

产酶细胞的选择

用于酶的生产的细胞必须具备的条件：

1、酶的产量高

2、容易培养和管理 3、产酶稳定性好 4、利于酶的分离纯化

5、安全可靠、无毒性

二、产酶微生物

1、放线菌（Actinomyces）

是呈菌丝状生长、以孢子进行繁殖、革兰氏染色阳性的一类原核微生物。由于菌落呈放射状而得名。

工业上常用的放线菌有：

链霉菌属 Streptomyces，生产抗生素、维生素、酶及酶抑制剂。

诺卡氏菌属 Nocardia，生产抗生素，石油脱蜡、烃类发酵， 处理含氰废水 小单孢菌属 Micromonospora，生产庆大霉素Rifamycin 孢囊链霉菌属 Streptosporanium 生产多霉素。

链霉菌属是放线菌中最大的一个属。

菌落呈放射状，有分支菌丝体，菌丝直径

0.2-1.2μm，G+。 菌丝有气生菌丝和基内菌丝之

分，基内菌丝不断裂，气生菌丝形成孢子链。可产生葡萄糖异构酶，纤维素酶，碱性蛋白酶，中性蛋白酶，几丁质酶，青霉素酰化酶等。

2、细菌

大肠杆菌（Escherichia coli）：谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等 芽孢杆菌（Bacillus）

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）中温α-淀粉酶，蛋白酶，纤维素酶 地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）高温α-淀粉酶，碱性蛋白酶 乳酸菌 谷氨酸脱羧酶

3、酵母菌

啤酒酵母（酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae）可产丙酮酸脱羧酶，醇脱氢酶等。 假丝酵母（Candida），可产脂肪酶、醇脱氢酶 巴氏毕赤酵母，甲醇酵母（Pichia pastoris ），基因工程优良表达宿主菌。

酵母菌落形态

固体培养基上菌落湿润、凸起、光滑。质地均匀，但是比细菌菌落大而厚、菌落颜色较为单

调，会有酒香。

酵母的形态 酵母菌电镜照片 4、霉菌

黑曲霉（Aspergillus niger） 米曲霉（Aspergillus oryzae） 青霉（Penicillium）

木霉（Trichoderma） 根霉（Rhizopus） 毛霉（Mucor）

红曲霉（Monascus）

黑曲霉（Aspergillus niger）

是一种重要的工业微生物，其代谢活力强，安全性高。菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丛黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生胞子球形，平滑或粗糙。

如黑曲霉可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。如，可产糖化酶、 α-淀粉酶、酸性蛋白酶，纤维素酶，果胶酶， β-葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶、柚苷酶等。 米曲霉（Aspergillus oryzae）

食品酿造中的常用微生物。菌落一般为黄绿色，后变为黄褐色，分生袍子头呈放射形，顶裹囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形，平滑少数有刺，分生孢子梗长2mm左右，粗糙。

米曲霉可用于生产蛋白酶和糖化酶，这在我国传统的酒曲和酱油曲中得到广泛应用。此外，米曲霉还用于生产真菌α-淀粉酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、核酸酶P1、果胶酶等。 青霉菌（Penicillium）

营养菌丝体无色、淡色或具鲜明颜色。菌丝有横隔，分生孢子梗亦有横隔，光滑或粗糙。分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，称为帚状体。分生孢子球形，椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生长时呈蓝绿色。 产黄青霉(Penicillium chrysogenum)用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶(主要作用于青霉素V,别名苯氧甲基青霉素)、果胶酶、纤维素酶等。

桔青霉(Penicillium citrinum)用于生产5’-磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶P1等。

木霉（Trichoderma）

生长时菌落呈棉絮状或致密丛束状，菌落表面呈不同程度的绿色。菌丝透明，有分隔，分枝繁复，分枝末端为小梗，瓶状，束生、对生、互生或单生，分生孢子由小梗相继生出，靠粘液把它们聚集成球形或近球形的孢子头。分生孢子近球形或椭圆形，透明或亮黄绿色。 木霉中的绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉、长梗木霉等是生产纤维素酶的重要菌株。 此外，木霉中含有较强的17α羟化酶，常用于甾体转化。 根霉（Rhizopus）

由营养菌丝产生匍匐枝，匍匐枝的末端生出假根，在有假根的匍匐枝上生出成群的孢子囊梗，梗的顶端膨大形成孢子囊，囊内生孢子囊孢子，孢子呈球形、卵形或不规则形状。

根霉可用于生产糖化酶、α-淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。

根霉有强的11-α-羟化酶，是用于甾体转化的重要菌株。 毛霉（Mucor）

毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，菌丝体上直接生长孢子囊梗，分枝较小或单生，孢子囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常带有针状的草酸钙结晶。 毛霉用于生产蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。 红曲霉（Monascus）

可产淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、蛋白酶等。

大型真菌 粉褶侧耳 草菇

三、动、植物细胞

植物细胞培养主要用于色素、药物、香精、酶等次级代谢产物的生产

动物细胞培养主要用于疫苗、抗体、激素、多肽、酶等功能蛋白质的生产

第二节 培养基的配制

微生物的元素组成和主要成分

一、培养基的基本成分

1、碳源：碳源是指能够为细胞提供碳素化合物的营养物质。是构成细胞成分的主要元素，

是提供细胞能量的能源，也是各种酶的重要组成元素。

实验室与工业微生物发酵中常用的碳源主要有葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精、有机酸、饴糖、玉米粉、甘薯粉、木薯、糖蜜、野生植物淀粉，以及麸皮、米糠、废糖蜜、造纸厂的亚硫酸废液等。

植物细胞以蔗糖为碳源；

动物细胞以谷氨酰胺或谷氨酸为碳源 碳源选择应注意：

细胞生长营养需求

碳源对酶生物合成的调节作用——诱导作用、分解代谢物阻遏作用 经济因素——来源、价格 对酶生产的工艺条件的影响 对酶分离纯化的影响

2、氮源

是组成细胞蛋白质和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要组成元素。 分为有机氮和无机氮两大类。

不同的细胞对氮源有不同的要求：动物细胞要求有机氮源；植物细胞主要使用无机氮源；微

生物细胞中，异养型细胞要求有机氮源，自养型细胞采用无机氮源。

工业及实验室用的氮源有：

有机氮：豆粕、花生饼粕、酵母粉（膏）、玉米浆（粉）、玉米蛋白、棉籽蛋白、酪蛋白、蛋白胨、牛肉膏、多肽、氨基酸等。

无机氮：氨水、硫酸铵、尿素、磷酸铵、硝酸铵、硝酸钠（钾）等各种铵盐和硝酸盐等。 碳氮比（C/N）：一般是指培养基中C的总量与氮元素N总量之比。可通过测定或计算培养基中碳和氮的总量而求出。

有时也采用培养基中碳源总量和氮源总量之比来表示碳氮比。

3、无机盐

其主要功能是：

①构成细胞的组成成分；P、S

②参与酶的组成；P、S、Zn、Ca、Mg

③作为酶的激活剂；K、Mg、Zn、Cu、Fe、Mn、Mu、Co、Br、I ④调节细胞渗透压，pH值和氧化还原电位；Na、K、Ca、P、Cl ⑤某些自氧微生物的能源和无氧呼吸时的氢受体。 主要元素（大量元素），P、S、K、Na、Ca、Mg、Cl、Fe等。

微量元素，Cu、 Zn 、Mn、Mu、Co、Ni 、Br、I等元素，一般是酶的辅助因子。

4、生长因子（生长因素）

是指细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、

生长激素等

能提供生长因子的天然物质有酵母膏、蛋白胨、麦芽汁、玉米浆、动植物组织或细胞浸液以

及微生物生长环境的提取液等。

生产上通常在培养基中添加玉米浆、酵母膏或纯的生长因子，以提供各种必需的生长因子。

培养基的设计原则

选择适宜的营养物质 营养物的浓度及配比合适 物理、化学条件适宜 经济节约

精心设计、试验比较

枯草杆菌BF7658 α-淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠 0.8%，硫

酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。 枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%, 糠1%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%（自然pH）。

黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%（pH4.4～5.0）。 地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉5.5%, 豆饼4%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。

黑曲霉AS 3.350酸性蛋白酶发酵培养基: 玉米粉6%, 豆饼粉4%, 玉米浆0.6%, 氯化钙0.5%, 氯化铵1%, 磷酸氢二钠0.2% (pH 5.5)。

游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠0。1%，硫酸镁0。05% (pH 7.2)。

桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%, 硫酸镁0.05%, 氯化钙0.04%, 磷酸氢二钠0.05%, 磷酸二氢钾0.05% (自然pH)。

黑曲霉AS3.396果胶酶发酵培养基: 麸皮5%, 果胶0.3%, 硫酸铵2%, 磷酸二氢钾0.25%, 硫酸镁0.05%, 硝酸钠0.02%, 硫酸亚铁0.001% (自然pH)。

枯草杆菌AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基: 葡萄糖0.4%, 乳蛋白水解物0.1%, 硫酸铵1%, 氯化钾0.1%, 氯化钙0.1mmol/L, 氯化镁1.0mmol/L, 磷酸氢二钠20mol/L ( 用pH7.4的Tris-HCl缓冲液配制)

第三节 产酶工艺条件及其调节控制 酶制剂的发酵生产过程图解 30升全自动发酵罐

工业发酵罐

诺维信工业发酵罐