1、一个标准的分子生物学实验室应该具备哪些硬件和软件？ 答：一个标准的分子生物学实验室应包含以下部分： 实验室（24-25℃）、仪器分析室（精密光学）、离心机室、细胞培养室、放射性核素操作室、冷室（4℃-8℃）、暗室（自显影、32P、蛋白）、消毒室、洗涤室、水处理室、恒温室（16℃，37℃）、动物饲养室等。 2、离心机都有哪些？划分依据？
答、普通离心机： 最大转速为6000r/min、最大离心力为6000g
高速离心机： 最大转速为25000r/min、最大离心力为89000g 超速离心机： 最大转速为90000r/min、最大离心力为694000g 离心机分类依据：
高速离心机是指转速高达20000到25000r/min，主要用于生物大分子的微量操作。超速离心机以其能超过500000g（75000r/min，r=8cm）的离心力。 普通离心机转速在6000r/min，最大离心力6000g。 3、实验室常规的仪器设备？ 答：温度控制系统：应该具备不同温控级别的冰箱，其中最常使用的有：4℃， -20℃，-80℃冰箱； 37℃温箱；烤箱；100℃水浴摇床；水的净化装置；消毒设备；计量系统：常用的电子天平等，可调式微量移液器等、PH计、紫外可见分光光度计；其他设备：微波炉，真空加热干燥箱，电泳凝胶干燥器，凝胶呈像系统等。
4、核酸纯化的试剂有哪些？都有什么作用，原理是是么？如何辨别酚是否能使用？不能使用的原因是什么？加入八羟基喹啉的作用是什么？β-巯基乙醇的作用又是什么？水饱和酚和TE饱和酚分别用在提取什么核酸上？酚怎么保存？ 答：
①核酸纯化过程中涉及到的主要试剂：酚，氯仿，异无醇。 酚：可有效地变性蛋白质，但是不能完全抑制RNA酶活性，而且酚能溶解10-15%的水，从而能溶解一部分poly(A)RNA。
氯仿：变性蛋白质，能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。 异无醇：异戊醇可以降低表面张力，减少在去除蛋白质过程中产生的泡末，另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下
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层有机溶剂相维持稳定，最后用氯仿处理，是去除核酸溶液中的迹量酚。用乙醚处理，可去除迹量氯仿。
③酚如果无色透明可以使用，变色（结晶曾现粉红色或黄色）则不可以使用。因为：酚已经被氧化而成醌、二酸，酚氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键，并引起DNA链的交联。
⑤加入八羟基喹啉的作用：减少酚的氧化；提供颜色指示(黄色), 使酚抽提时分层界面易于鉴别, 同时也指示酚的储存时间与质量；抑制RNA酶的活力；螯合金属离子并抑制DNA酶作用。
⑥β-巯基乙醇：是还原剂减少酚被氧化。 ⑦水饱和酚用在提RNA； TE饱和酚用在DNA。
⑧蒸馏酚要装入棕色试剂瓶中，4℃保存一个月。
乙醇的作用：核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸, 加乙醇的目
的就是沉淀核酸。
5、沉淀核酸加什么阳离子？提取那一种核酸加什么离子？作用原理是什么？ 答：①核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，它与纳、钾、镁、形成的盐在许多种有机溶剂中不溶解，但也不会被有机溶剂变性，形成两相。 ②氯化纳用于沉淀提取液里含有SDS的DNA样；
醋酸铵：反转录酶、DNA聚合酶、Tag酶、以及末端转移酶和磷酸化酶等催化的生化反应，为去除未掺入的dNTP和NTP，普遍使用铵离子沉淀核酸，但是铵盐是T4噬菌体多核苷酸激酶的抑制剂！在DNA需要进行磷酸化和末端补平反应时，不能采用铵盐沉淀； 氯化锂：在0.8mol/L LiCl的强离子浓度条件下，可溶解tRNA与5S RNA， 而大分子量的mRNA、rRNA则不溶解，可通过离心进行分离，常用于mRNA提取。
氯化镁：Mg2+是核酸沉淀中的有效离子, 当核酸浓度低于0.1ug/ml 或长度小于100个核苷酸时，加入10mM/L M 2+可明显提高核酸沉淀的回收率。 醋酸钾:沉淀效果和醋酸钠相同，但是核酸的钾盐形式很难溶于含有SDS的溶液，所以，如果在提取核酸的缓冲液中有SDS时，不易采用。 6、沉淀核酸常见的温度，时间，离心转速和时间通常在什么范围之内？ 答：①一般条件下的DNA沉淀，使
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用0 ℃冰水，10~15分钟可达到实验的要求。 ②大多数的DNA沉淀可在0~4℃，12000g离心10分钟即可，对于浓度低于20ng/ml的DNA沉淀，上述离心条件也可以完成。如DNA片段小于100个核苷酸时，则需要超速离心；27000r/min，1-2小时，4 ℃条件下进行。如果对于pg水平的核苷酸，则应该加入tRNA作为载体进行共沉淀。 7、为什么要用乙醇沉淀核酸？
答：沉淀DNA时，乙醇是首选的有机溶剂，它对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的迹量乙醇易蒸发去除。在适当的盐离子浓度下，2倍体积的95%乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA，则需要将乙醇的量增加2.5倍
8、核酸的定量，定量的原理是什么？纯度，完整性有哪些手段评价？核酸如何保存？
答：①组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波 长250~270nm之间,利用这一特性可以用紫外分光光度法定量测定核酸。在波长260nm紫外线下，1 OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。 ②分光光度法即可测定核酸的浓度，也可确定核酸的质量。A260/280的比值：DNA为1.8， 如果比值高于1.8，说明DNA制剂中有RNA存在；如果比值低于1.8，说明污染有蛋白质或提取过程中残留的酚等，RNA样品OD 260/280的比值小于2 ③完整性可以用琼脂糖凝胶电泳检测，在有标准Marker存在下，通过电泳跑出的条带多少、大小可以比对提取的核酸是否完整。
④DNA：最好是溶于TE中于4℃保存，其中EDTA是通过整合金属2价离子，来抑制DNA酶的活性。TE的pH为8，是为了减少DNA的脱氨反应，放在-70 ℃能保存5年以上。
RNA：溶于0.3mol/L醋酸钠（pH5.2)或双蒸消毒水中，储放于-70 ℃。长期保存可以以沉淀的形式储存于乙醇中，在-20℃的情况下，非常安全。 9、何为限制性内切酶？分类？各个类型的特点？常用的主要二是型限制性内切酶有哪些特点？
答：①核酸限制性内切酶：是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解 酶。这些酶都是从原核生物中发现的。 ②分为I、II、III
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③I型酶：属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性，需要Mg 2+、ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸作为辅助因子，在DNA降解时伴随有ATP的水解。即它具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶、和DNA解旋酶四种活性。若酶的识别位点上两条DNA链均未甲基化，就能行使内切酶功能，切割DNA；如果一条DNA链上被甲基化，这个酶就发挥修饰功能，使另一条DNA链甲基化。显著特点：在DNA链上的识别位点和切割位点不一致！ III型酶：与I型限制性内切酶的特性类似，也有甲基化功能，但是无ATP和DNA解旋酶活力。不同的是它能在DNA链上的特异位点切割，其切割位点在识别位点以外。所以，应用价值不大。 II型酶：通常指的是DNA限制性内切酶，
? II型酶分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组成。
? II型限制酶分子量小，需要Mg2+作为催化反应辅助因子，它们能识别双链 DNA的特异序列，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段。 ? 识别序列一般为4~6个碱基对，识别的顺序为反转重复序列，且富含GC。 ? II型DNA限制性内切酶的靶序列大小决定了它切割DNA后产生DNA片段
的长短。若DNA链上的碱基随机分布，在一条很长的DNA链上，对于识别4个核苷酸的内切酶，平均44个核苷酸长度就出现一个靶序列；
? II型DNA限制性内切酶切割双链DNA后产生三种不同的切口：1）在识别 顺序的对称轴上，对双链同时切割形成平末端；2）在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5`末端切割产生5`端突出的粘性末端（EcoR I)；3）反之，产生3`端突出的粘性末端（如PstI）。
? II型DNA限制性内切酶不具有甲基化修饰活性，这一功能由相应的修饰酶 承担。它们识别同一DNA特定序列，发挥不同的作用。 ? 一些特殊性质的少数II限制性内切酶：
1、异源同工酶，也称同裂酶：是不同来源分离出来的不同酶，但是具有相同的识别序列，切割DNA的方式可以相同，也可不同。
2、Subset酶：识别与切割顺序相互有关的酶，如：Smal的6个核苷酸序列中包含有HpaII的四个核苷酸序列
3、远距离裂解酶：这类酶的识别位点与切割位点不一致，它们在某一核苷酸区域与识别序列相结合，然后滑行到识别序列以外的另一个位点进行切割，这一
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特性与I型酶类相似，但是，它的切割位点与识别位点是一定的，而且没有I型酶那么远，一般为10个碱基左右。
4、可变酶：这类酶是II型酶中的一个特例，它们的识别序列中的1个或几个核苷酸是可变的，并且其识别序列一般大于6个碱基。
II酶酶通常指的是DNA限制性内切酶，II型酶分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组成。 II型限制酶分子量小，需要Mg2+作为催化反应辅助因子，它们能识别双链DNA的特异序列，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段。II型限制酶的识别序列一般为4~6个碱基对，识别的顺序为反转重复序列，即具 有180℃的旋转对称性，且富含GC。
10、二型限制性内切酶酶切之后会产生什么样的末端？并图示出来？3突起，5突起，平端？
答：①II型DNA限制性内切酶切割双链DNA后产生三种不同的切口：1）在识别顺序的对称轴上，对双链同时切割形成平末端；2）在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5`末端切割产生5`端突出的粘性末端（EcoR I)；3）反之，产生3`端突出的粘性末端（如PstI）。
②平端Alu I: AGTGCGTAG↓CTCGCGTAGT TCACGCATC GAGCGCATCA 5‘端突起的黏性末端
EcoR I: 5’-AGTGCG AATTCGCGTAG-3’ 3’-TCACGCTTAA GCGCATC-5’ 3`端突出的粘性末端 Pst I酶切:
5’-TAAGTGCTGCA GGCGT-3’ 3’-ATTCACG ACGTCCGCA-5’ 11、限制性酶切缓冲体系化学成分，其作用？加牛血清白蛋白的作用？反应温度通常是多少？酶切时间与酶量身什么关系？怎样计算？酶多加或者少加有什么关系？为什么要定在50微升？200微升行不行？加EDTA为什么能终止反应？部分酶切？ 答：①反应缓冲液的成分主要是：Tris.Cl、NaCl和Mg 2+，内切酶都需要Mg 2+ 作为辅助因子，Buffer 的pH一般为7.2-7.6之间。
②有的限制性内切酶的反应需要BSA，加小牛血清的作用是稳定酶的构象 ③绝大多数限制性内切酶的反应温度为37℃。
④酶解时间可通过加大酶量而缩短。酶量少，可通过延长酶解时间以达到完全酶解DNA的目的。同时与加入的DNA量也有关。
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⑤酶的量根据酶催化活性和DNA的量来计算：酶的活性单位是1小时内在50ul容积中，酶解1ug DNA所需要的酶量，那么先测定所要酶切的DNA样的量X微克，那么酶溶液的量为：X乘以酶活性单位就等于所加酶体积。加入的酶量或容积不能超过反应总体积的10%。
⑥可以通过加入EDTA来终止酶切，因为EDTA为镁离子的螯合剂，从而使酶失去活性终止酶切。
⑦部分酶切就是利用上一原理，通过在一定时间内加入EDTA来中断酶切实现。部分酶切即原本DNA链上有2个酶切位点，但是我们想只在一个位点酶切，而另外一个位点不发生酶切，可以调整加入EDTA的时间实现部分酶切。 12、影响电泳的四大因素？不同构型的DNA在电泳时的迁移速率关系？琼脂 糖凝胶电泳中EB染色原理？借助什么工具检测？ 答：①分子大小、电荷多少、颗粒形状、空间构型。
②质粒DNA存在闭环( I型, CC), 单链开环(II型, OC), 线型(III型, L)。三者之间的迁移率，一般为I型>III型>II型。
③溴化乙锭(ethidium bromide, EB)是一种荧光染料，扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。激发荧光的能量来至两个方面，一是核酸吸收波长为260nm的紫外线后将能量传送给溴乙锭，二是结合
在DNA分子中的EB本身，主要吸收波长为300nm和360nm的紫外线的能量，两方面的能量，最终激发EB发射出波长为590nm的可见光谱红橙区的红色荧光。 染色一般是在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5 ug/ml 的EB；染色10 min；EB见光易分解，所以保存在棕色试剂瓶中4℃储存。（备注：视题的分值答题，小题只需简略，答题详尽）
④借助于凝胶成像系统来检测电泳情况，在紫外光（波长为300nm）下照射激 发荧光，并且拍照。
13、质粒DNA提取后会出现几中情况？3种带个代表什么，分别在什么位置？ 答：①在提取质粒后，视操作人员的技术熟练程度可分为3中情况：质粒DNA存在闭环( I型, CC), 单链开环(II型, OC), 线型(III型, L)。
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②在电泳时三者之间的迁移率，一般为I型>III型>II型。所以在琼脂糖电泳后在凝胶（自点样孔往下依次排列为）单链开环的质粒----线性质粒-----闭合环状质粒。
14、电泳缓冲液PH范围，此时核酸带什么电荷，电泳是往那一电极移动？点样点在那一电极，电极怎么接？
答：①琼脂糖凝胶电泳的PH范围在8.0-8.3，此时由于外界PH值大于核酸分子的PI值，核酸带负电荷，在电泳时往正极移动。
②样品点在靠电源负极，外接电源，黑色线接负极，红色线接正极。 15、两种指示染料的名字，分子量各是多少？优缺点？
答：溴酚蓝(bromophenol blue,Bb): 分子量为670道尔顿，呈蓝紫色，在不同浓度的凝胶中，迁移速度基本相同，它的分子筛效应小，近似于自由电泳，故被普遍用作指示剂，在0.6%,1%,2%的琼脂糖凝胶电泳中，其迁移率分别与1KB，0.6KB和0。15KB的双链线性DNA片段大致相同。
二甲苯青蓝(xylene cyanol, Xc)): 分子量为554.6道尔顿,呈蓝色, 携带电荷比溴酚蓝少，在凝胶中迁移率比溴酚蓝慢，在5%的PAGE和含7-8mOL/L尿素PAGE胶中迁移率分别相当于260mer和130mer的寡核苷酸。
16、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，分辨范围是多大？琼脂糖胶的分辨率？跟琼脂糖凝胶电泳的差别？
答：与SDS结合的蛋白质的构型发生变化，在水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状，使得SDS-PAGE电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。这就是SDS-PAGE的原理。
① 聚丙烯酰胺凝胶电泳适合于低分子量蛋白质（低于100道尔顿）、寡聚核苷酸的分离和DNA的序列分析。聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片段DNA（5-500bp），效果最好，聚丙烯酰胺凝胶电泳具备分离相差一个核苷酸的不同DNA片段的特性。
琼脂糖凝胶的孔径大，可以分离长度为100bp至60kb的DNA分子。 区别：DNA电泳一般使用的都是琼脂糖凝胶电泳，电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷。
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聚丙烯酰氨（PAGE）凝胶电泳用于蛋白质与寡糖核苷酸的分离。电泳的驱动力靠与蛋白质结合的SDS上所携带的负电荷。蛋白质电泳（一般指SDS-PAGE）
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