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茶树新梢内源激素的HPLC分析及日变化_钱利生

2023-03-06 来源:九壹网
 

茶 叶 科 学 1996,16(2):J.TeaSci.

135—139

 

茶树新梢内源激素的HPLC分析及日变化

钱利生 沈生荣 潘根生

(浙江农业大学茶学系,杭州310029)

*

摘  要

  研究了茶树新梢内源赤霉酸(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚乙醛(IAAD)、脱落酸(ABA)和玉米素(Zeatin)等激素的HPLC分析方法。在ODS(C18)反相柱上,GA3、IAA、IAAD和ABA用甲醇—乙腈—KH2PO4缓冲液系统为流动相、Zeatin用甲醇—乙腈—磷酸缓冲液系统为流动相得到满意的分离,它们与相邻峰间的峰高分离度均在0.65以上。在紫外波长λGA3=210nm,λ、灵敏度0.003aufs(GA3)和0.001aufs(IAA、IAAD、ABAIAA、IAAD、ABA=280nm和λZeatin=254nm和Zeatin)条件下,各种激素得到定量。GA3、IAA、IAAD、ABA和Zeatin的平均标样添加回收率分别为76.24%,89.69%,84.33%,90.96%和82.09%。茶树新梢内源激素含量在一天内有明显的变化,其高峰值均出现在13时左右。一天内以10—16时取样进行内源激素测定较适宜。

关键词:茶树 内源激素 高效液相色谱 定量分析 日变化

HPLCAnalysisandDiurnalVariationoftheEndogenous

HormonesintheShootsofteaPlants

QianLisheng,Shen Shengrong,PanGensheng

(DepartmentofTeaScience,ZhejiangAgriculturalUniversity,Hangzhou310029)

Abstract

  Amethodwasestablishedforquantitativeanalysisofgibberellicacid(GA3),indole-3-aceticacid(IAA),indole-3-acetaldehyde(IAAD),abscisicacid(ABA)adnZeatininteaplantsbyreverse-phaseHPLC.SeperationandpurificationoftheendogenoushormoneswereobtainedonananalyticalODSC18column(5.0×150mm),elutedwiththesolventdeliverysystemsmethanol-ethylnitrile-KH2PO4buffer(GA3,IAA,IAADandABA)andmethanol-ethylnitrile-phosphoricacidbuffer(Zeatin)respectively.Theirresolutionstotheneiboringpeakswereallabove0.65.TheyweredetectedbyUV-detectorat210nm(GA3,0.003aufs),280nm(IAA,IAADandABA,0.001aufs)and254nm(Zeatin,0.001aufs),andquantifiedbyHPLC,withaveragerecoveryratesof76.24%,89.69%,84.33%,90.96%and82.09%respectively.DiurnalvariationsinlevelsoftheendogenoushormoneswerealsoinvestigatedbytheHPLCmethodestablished.Thecontentsfluctuatedsignificantlydailyandreachedthemaximumatabout1pm.Itissuggestedthatsamplesoftea

  文稿收到日期:

1996—01—02  修改稿收到日期:

1996—05—24

*浙江省教委资助项目内容之一。

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 茶 叶 科 学16卷 

shootsbecollectedfrom10amto4pmforthesuitablequantificationoftheendogenoushormones.

Keywords:

Teaplant Endogenoushormone HPLC Quantitativeanalysis Diurnalvariation

前  言

自70年代初以来,高效液相色谱(HPLC)被广泛应用于除乙烯外的植物激素分析,它具有高灵敏度和选择性、重复性好和分析速度快等特点,符合高精度生物痕量分析要求。由于它对保留时间的分辨率有一定限度,故对前处理要求高,否则会有一种以上的化合物保留时间相同或接近。特别是GAs,因无特异紫外吸收而在较远紫外区域检测易受杂质干扰,目前仅牵牛、泡桐和荞麦等少数生化成份不太复杂的植物能直接用HPLC定量,在某些林木萌芽中虽能定量但方法尚不稳定。茶树生化成分复杂,增加了激素HPLC分析难度。潘根生在1991年首次成功地利用HPLC完成了茶树IAA和ABA分离定量。目前茶树Zeatin也能利

〔5〕

〔4〕

〔3〕

〔1〕

〔2〕

用HPLC分析,但需经二次HPLC才能定

量。茶树GA3的HPLC分析尚未见报道。本文研究了茶树内源激素HPLC分析方法。

〔6〕

材料和方法

1.材料及处理

植物材料为浙江农业大学茶学系实验茶园水古品种。白天7—19h每隔3h取样1次。取样标准为一芽二叶,采后立即贮于-20℃冷柜内待测。植物激素标样为赤霉酸(GA3)、吲哚-3-乙酸(IAA)、玉米素(Zeatin)、脱落酸(ABA)和吲哚乙醛(IAAD),除GA3为日本和光纯药工业株式会社产品外,其余标样均为Sigma公司产品。

2.植物激素的提取、分离和纯化

〔8〕

参考丁静〔7〕、HeddenP和潘根生〔5〕等

的方法并加以改进,具体步骤如图1所示。

图1 植物激素的提取分离和纯化流程图

 Procedureofextraction,solventfractionationandpurificationofplanthormonesinteashootsFig.1 2期

钱利生等:茶树新梢内源激素的HPLC分析及日变化 137

-1

  3.回收率测定

采用添加回收率测定法。准确称取2g

重茶树新梢试样2份,一份在研磨时加入GA3、IAA、IAAD、ABA和Zeatin标样,另一份不加激素标样,分别按图1步骤获得上清液,测得两种试样的植物激素色谱峰面积,以添加标样试样的激素峰面积分别减去未加标样样品的相应峰面积所得差值与相应激素标样峰面积之比(百分比)作为回收率,重复5次。

4.HPLC分析

高效液相色谱仪(日本岛津LC-10A型),LC-10AD泵,ODS(C18)反相分配柱( 5.0mm×150mm),柱温40℃,SPD-10A紫外检测器,C-R7A数据处理仪,记录纸速5mm·min。用于GA3分析的流动相为甲醇—乙腈—KH2PO4缓冲液系统(15∶

-1

15∶70,V/V,pH3.0),流速0.8ml·min,

灵敏度0.003aufs,紫外检测波长210nm;用于检测IAA、IAAD和ABA的流动相为甲醇—乙腈—KH2PO4缓冲液系统(20∶20∶60,V/V,pH3.5),流速1ml·min-1,灵敏度0.001aufs,紫外检测波长280nm;用于检测Zeatin的流动相为甲醇—乙腈—磷酸缓冲液系统(15∶15∶70,V/V,pH7.0),流量0.8ml·min,灵敏度0.001aufs,紫外检测波长254nm。

-1

结果与分析

1.植物激素HPLC测定的标准曲线采用外标法进行各种植物激素的定量。各种激素标样分别配制成不同的标准系列溶液,按照本文的色谱条件上HPLC。图2是激素标样的标准曲线,标样浓度与色谱峰面积

图2 HPLC测定植物激素的工作曲线

Fig.2 WorkcurvesofstandardplanthormonesusedintheHPLCanalysis

间呈极显著的线性相关。

2.新梢内源激素的检测、分离度及回收率

将GA3、IAAD、IAA、ABA和Zeatin等

植物激素标样甲醇溶液和茶树新梢试样提取上清液,在相同的色谱条件下,分别注入HPLC仪,茶样中均出现与标样具有相同保留时间(tR)的激素色谱峰。标样添加回收率测定试样的上清液上HPLC后,在这些激素的保留时间处色谱峰高和峰面积均增大,说明茶树新梢内源激素和添加标样叠加出峰。其保留时间、5次重复的平均回收率如表1所示。激素的色谱峰与其前后相邻峰间的峰高分离度(Rh,即两相邻峰平均高度处和两 138

 茶 叶 科 学16卷 

峰间峰谷的距离f与两相邻峰的平均高度g的比值,Rh=f/g)均在0.65以上,说明茶

树新梢中内源激素色谱峰已达到满意的分离效果,所选择的激素提取分离纯化和HPLC

表1 茶树内源激素HPLC分析的保留时间、回收率和分离度

Table1 Retentiontimes,recoveryratesandresolutionsofthehormonesinteashootsbyHPLC

植物激素HormonesGA3IAAIAADABAZeatin

重  复Duplicate(n)55555

保留时间Retentiontime

(min)13.6716.5713.9525.9111.84

回收率Recoveryrate

(%)76.2489.6984.3390.9682.09

变异系数Coefficientofvariation

(%)9.563.576.315.873.14

与前峰Tothepreceding

peak0.88240.88880.92310.80950.7797

分离度Resolution

与后峰Tothefollowing

peak0.89620.83720.65211.00000.8904

  注:峰高分离度(Rh)=两峰连线中点至峰谷距离(f)/两峰平均高(g)

Note:Theresolutionisindicatedbytheratioofftog,heregisthemeanheightofthetwopeaksandfisthedistance

betweenthemeanheightandthevalleyofthetwopeaks

色谱条件是可行的。

3.茶树新梢内源激素含量的日变化HPLC分析结果(图3)表明,茶树新梢内源激素含量在一天内是不恒定的,其峰值均出现在13时附近。促进生长的激素GA3和Zeatin的含量在清晨和傍晚均较低,而在10—16时较高且较恒定;IAA及其生物合成重要中间物IAAD含量的日变化与GA3和Zeatin相似。抑制生长的激素ABA在清晨和傍晚相对较高,而在7时后急剧下降,10时或16时附近均相对较低,但在13时出现一高峰值,这可能是因为中午日照较强,茶树需要较高的ABA含量来调节气孔,因此整个ABA的日变化曲线似一倒置的光合作用日变化双峰曲线。在ABA含量的低谷值附近及峰后促进生长的激素含量迅速增加。在一天内GA3和ABA含量的变化幅度较其他激素大。

稳定。在激素中GA3最难检测,它们一般无特异紫外吸收,因而会影响到测定结果的灵

图3 茶树新梢内源激素含量的日变化

(1994.05.12,水古)

 Fig.3 Diurnalfluctuationofthecontentsof

theendogenoushormonesinteashoots(cv.Shuigu05/12/1994)

讨  论

国内虽有大量直接利用HPLC分析激素的报道〔22〕,但往往分离效果不尽满意,尤其在一些生化成分较复杂的植物中方法尚不敏度,因此应选择不同于其他激素的检测波长进行HPLC分析。GAS的HPLC分析的另一个难题是在HPLC出峰时间较早

〔2,3〕

,易

 2期

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与杂质峰相重叠甚至无法检出。因此,选择恰当的分离纯化步骤,以尽可能除去试样中的杂质和采用适当的色谱条件,使各组份尽可能完全分离,成为植物激素HPLC分析的

关键。本文采用同一前处理分离纯化步骤,选择不同的色谱条件,5种物质同时得到成功的HPLC分析。特别是GA3的出峰时间延后而避免与杂质峰重叠。5种物质色谱峰与前后相邻峰的峰高分离度均在0.65以上,GA3的回收率有所提高并接近80%(罗正荣等HPLC结果为68.81%,丁静等生物鉴定法为70%),其他4种化合物均在80%以上。因此本文的HPLC方法已满足植物激素痕量分析的要求。IAAD则是首次用HPLC直接定量。本研究除所定量的激素峰外还有许多其他峰存在。这就进一步表明我们选择的前处理步骤和HPLC条件是可靠的。因为目前已知GAs和CTK等都有很多种类〔9〕,它们的分子结构相近,理论上讲经同一前处理后大部分会保留下来,并在合适的色谱条件下得到分离。同时,茶树新梢生化成份极为复杂。因此,该方法要比选择生化成份较为简单的植物材料所建立的方法更稳定可靠,因而具有普遍意义,即适用于其他植物内源激素的HPLC分析。

茶树新梢内源激素含量在一天中的变化是明显的,这又从一个侧面反映出激素调控植物生理生化过程。这种变化也正是激素能作为生长调节物质,对植物生长进行调节和对外界环境条件变化迅速作出应答反应所必须具备的条件。这种日变化结果,表明了在

进行植物生理生化研究定量内源激素时,应选择适当的取样时间,尤其应注意固定每天的取样时间。从本文结果看,一天中以10—16时取样较适宜。

致  谢

实验过程中得到本系徐月荣先生和本校中心实验室臧荣春先生的热情帮助,日本静冈大学小西茂毅教授和久保井彻副教授为本研究提供植物激素标样,在此一并表示谢忱。

参 考 文 献

1 BarendseGWM,VandeWerkenPH.High-performance

liquidChromatographyofgibberellins.JournalofChro-:matography,1980;198析化学,1984;12(6):

449-455531—532

2 王文芝.反相高效液相色谱分离泡桐中的植物激素.分3 张政,张强,林汝法等.荞麦幼苗内源激素的高效液相色谱测定法.色谱,1994;12(2)140—1414 夏民州,汪安琳.表油菜素内酯对湿地松苗内源激素的影响,植物生理学通讯,1993;29(5):科学,1991;11(1):业通报,1993(1):

25—2839—40

27—39351—353

5 潘根生.茶树生育与内源生长素和脱落酸的关系.茶叶6 董德贤.茶树内源细胞分裂素的高效液相色谱分析.茶7 丁静,沈镇德,方亦雄等.植物内源激素的提取分离和生物鉴定.植物生理学通讯,1979(2):

8 HeddenP,CrokerSJ.GC-MSanalysisofgibberellinin

planttissues.ln:MolecularAspectsofHormonalRegu-lationofPlantDevelopment(KutacekMed.)SPBA-cademicPublishing,1990:ysis.

ln:

19—30

9 HorganR.lnstrumentalmethodsofplanthormoneanal-PlantHormonesandTheirRoleinPlant

222—239

GrowthandDevelopment(DaviesPJed).MartinusNi-:jhoffPublishers,Dordrecht,1987

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