超高效液相色谱法测定柑橘果肉中四种植物性内源激素的含量

作者：蒋艳芳，黄岛平，陈秋红，等 来源：《湖北农业科学》 2012年第1期

蒋艳芳，黄岛平，陈秋红，黄 艳

（广西分析测试研究中心，南宁 ５３００２２）

摘要：利用超高效液相色谱法同时测定柑橘（Citrus reticulate Bance）果肉中的玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脱落酸的含量。以Ｃ８色谱柱，甲醇－０．１％冰乙酸为流动相梯度洗脱，检测波长为２６２ ｎｍ，流速０．２２ ｍＬ／ｍｉｎ。结果表明， 玉米素含量在０．１４～０．３８ μｇ／ｍＬ间线性关系良好，Ｒ２为０．９９９ ５，平均回收率为９８．７％，ＲＳＤ为 ０．９９％；赤霉素含量在０．６７～１．７９ μｇ／ｍＬ间线性关系良好，Ｒ２为０．９９９ ３，平均回收率为９８．６％ ，ＲＳＤ为０．７０％；吲哚乙酸含量在０．２

５～０．６７ μｇ／ｍＬ间线性关系良好，Ｒ２为０．９９９ ６，平均回收率为９９．０％ ，ＲＳＤ为０．６８％；脱落酸含量在０．０３６～０．０９６ μｇ／ｍＬ间线性关系良好，Ｒ２为０．９９９ ９，平均回收率为９９．１％ ，ＲＳＤ为０．６１％。该方法简便、快速、精密度高、准确性好，可用于植物样品中激素含量的测定。

关键词：柑橘（Citrus reticulate Bance）；植物激素；超高效液相色谱法

中图分类号：Ｏ６５６．２

文献标识码：Ａ

文章编号：0439－８114（２０12）01－0165-04

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｕｒ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｉｎ Ｏｒａｎｇｅ Ｐｕｌｐ ｂｙ ＵＰＬＣ

ＪＩＡＮＧ Ｙａｎ－ｆａｎｇ，ＨＵＡＮＧ Ｄａｏ－ｐｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｑｉｕ－ｈｏｎｇ，ＨＵＡＮＧ Ｙａｎ

（Ｇｕａｎｇｘｉ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｚｅａｔｉｎ （ＺＴ）， ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ （ＧＡ）， ｉｎｄｏｌｅ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ （ＩＡＡ） ａｎｄ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ （ＡＢＡ） was proceeded ｂｙ ＵＰＬＣ． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｅｄ ａ Ｃ８ ｃｏｌｕｍｎ， ａｎｄ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｈｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｍｅｔｈａｎｏｌ－０．１％ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ＵＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ２６２ ｎｍ， ａｎｄ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｗａｓ ０．２２ ｍＬ／ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ZT ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ０．１４ μｇ／ｍＬ and ０．３８ μｇ／ｍＬ， Ｒ２ ｗａｓ ０．９９９ ５， ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９８．７％， ａｎｄ ＲＳＤ ｗａｓ ０．９９％．Ｔｈｅ ｃａｌ

ｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＧＡ ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ０．６７ μｇ／ｍＬ and １．７９ μｇ／ｍＬ， Ｒ２ ｗａｓ ０．９９９ ３， ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９８．６％， ａｎｄ ＲＳＤ ｗａｓ ０．７０％．Ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ IAA ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｂｅｔｗｅｅｎ

０．２５ μｇ／ｍＬ and ０．６７ μｇ／ｍＬ， Ｒ２ ｗａｓ ０．９９９ ６， ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９９．０％， ａｎｄ ＲＳＤ ｗａｓ ０．６

８％． Ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＡＢＡ ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ０．０３６ μｇ／ｍＬ～０．０９６ μｇ／ｍＬ， Ｒ２ ｗａｓ ０．９９９ ９， ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９９．１％， ａｎｄ ＲＳＤ ｗａｓ ０．６１％． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｓｉｍｐｌｅ， ｐｒｅｃｉｓｅ， ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｃould ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｏｒａｎｇｅ ｐｕｌｐ（Citrus reticulate Bance）； ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅ； ＵＰＬＣ

植物性内源激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的微量有机物，其生理效应复杂多样，对植物生长发育有重要的调节控制作用［１，２］。吲哚乙酸、赤霉素、脱落酸、玉米素是植物体广泛存在的植物激素，本研究运用超高效液相色谱（ＵＰＬＣ）法同时测定柑橘中这４种内源激素，利用ＵＰＬＣ超高分离度、快速、超高灵敏度的优点，解决传统ＨＰＬＣ在植物激素分析中存在的分离度差，分析时间较长的缺点。本研究建立了植物内源激素高效、稳定、准确的分离和测定方法，为植物内源激素调节其营养生理与生长的研究提供支撑。

吲哚乙酸（ＩＡＡ）是一种植物体内普遍存在的含有一个不饱和芳香族环和一个乙酸侧链的内源激素，属吲哚类化合物，又名生长素，其基本作用在于调节植物生长；赤霉素（ＧＡ）是一类属于双萜类化合物的植物激素，典型生理作用是能促进枝条的生长，尤其是能促进无伤害植物的整体生长；脱落酸（ＡＢＡ）是一种具有倍半萜结构的抑制生长的植物激素，因能促使叶子脱落而得名，具有加速植物器官脱落，抑制整株植物或离体器官的生长，并对细胞的分裂与生长起抑制等作用；玉米素（Ｚｅａｔｉｎ）是一种天然的细胞分裂素，化学名称为６－（４羟基－３－甲基－２－反丁烯基）氨基嘌呤，它是从甜玉米灌浆期的子粒中提取并结晶出的第一个天然细胞分裂素，能刺激植物细胞分裂，促进叶绿素形成，加速植物新陈代谢和蛋白质的合成，从而达到有机体迅速增长，促使作物早熟丰产，提高植物抗病抗衰抗寒能力。

１ 材料与方法

１．１ 仪器和试剂

ＡＣＱＵＩＴＹ Ｕｉｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣ超高效液相色谱系统，Ｅｍｐｏｗｅｒ色谱工作站，检测器：ＰＤＡ ｅλ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ紫外检测器（Ｗａｔｅｒｓ公司）；台式系列数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

玉米素标准品（Ｓｉｇｍａ公司，纯度８７．０％）；赤霉素标准品（ＳＵＰＥＬＣＯ公司，纯度９６．５％）；吲哚乙酸（Ｒｉｅｄｅｌ－ｄｅ Ｈａｅｎ公司，纯度９９．０％）；脱落酸（Ｓｉｇｍａ公司，纯度９９．０％）；甲醇（色谱纯）；冰乙酸（分析纯）；超纯水；Ｃ１８柱（５００ ｍｇ／６ ｍＬ，美国赛分科技公司）。

１．２ 实验方法

１．２．１ 样品采集 实验所用的柑橘样品均采自广西全州。在不同时间共采集６组样品。摘取生长中的柑橘果实，迅速放入冰盒中带回实验室，－２０℃保存备用。

１．２．２ 色谱条件 色谱柱：ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＲＢＥＨ１３０ Ｃ８，１．７ μｍ（２．１×５０ ｍｍ）；流动相：甲醇－０．１％冰乙酸梯度洗脱；流速０．２２ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长为２６２ ｎｍ；柱温为２５ ℃。

１．２．３ 标准溶液的制备 分别精密称取玉米素、赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸标准对照品０．１２、０．２８、０．２１、

０．１５ ｍｇ置于５０ ｍＬ容量瓶中，５０％甲醇溶解定容，配制浓度分别为２．４、５．６、４．２、３．０ μｇ／ｍＬ的标准储备溶液。

１．２．４ 样品溶液的制备 称取已匀浆的柑橘果肉５．０００ ０ ｇ置于２５ ｍＬ容量瓶中，用８０％甲醇溶解，冰水浴超声４５ ｍｉｎ，取出恢复常温后，８０％甲醇定容，过滤，取过滤液１０ ｍＬ于１０ ｍＬ分度比色管，氮吹去除甲醇，残留液于Ｃ１８柱中脱色，用６．０ ｍＬ流动相分３次洗脱，用１０ ｍＬ分度比色管收集所有从Ｃ１８柱的流出液，流动相定容至８．０ ｍＬ，用０．２２ μｍ有机滤膜过滤，滤液即为待测液。

１．２．５ 四种植物激素混合标准曲线的制备 分别吸取玉米素、赤霉素、吲哚乙酸及脱落酸标准储备溶液０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６ ｍＬ于６个１０ ｍＬ容量瓶中，流动相定容至刻度，依次进样，进样体积为５．０ μＬ。

２ 结果与分析

２．１ 提取方法的确定

据文献报道，玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脱落酸４种激素可采用６７％的丙酮水溶液［１］、０．５ ｍｏＬ／Ｌ ＮａＯＨ溶液［３］、８０％甲醇水溶液［４］等溶剂提取，石油醚、乙酸乙酯、ＰＶＰ和Ｃ１８柱等方式净化，根据４种激素对时间和热不稳定［４］，易发生降解反应，所以在实验操作过程中应注意控制时间及温度，本试验通过对不同的提取溶剂，提取方式（超声提取、过夜浸提）、提取时间、提取次数分别做单因素考察实验，最终确定以８０％甲醇为提取剂，冰水浴超声提取４５ ｍｉｎ，Ｃ１８柱净化为最佳实验条件。

２．２ 色谱条件的选择

２．２．１ 色谱柱的选择 植物样品中含杂质量较多，分离难度较大。ＵＰＬＣ选用粒径低于２ μｍ的小颗粒作为填料，比普通ＨＰＬＣ有更高的分离度、灵敏度和分析速度，因此对分离测定植物样品中的４种激素具有较大的优势。本实验选用ＡＣＱＵＩＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ１３０ Ｃ１８ １．７ μｍ（２．１×１００ ｍｍ）、ＡＣＱＵＩＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ８ １．７ μｍ（２．１×５０ ｍｍ）和ＡＣＱＵＩＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７ μｍ（２．１×５０ ｍｍ）分别对样品进行分离测定，结果显示用ＡＣＱＵＩＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ８ １．７ μｍ（２．１×５０ ｍｍ）能够对样品进行很好的分离。

２．２．２ 波长的选择 将４种激素的混合标准溶液于ＡＣＱＵＩＴＹ超高效液相色谱系统上进行测定，ＰＤＡ紫外检测器对其进行光谱扫描，最大吸收光谱的波长分别为：玉米素（ＺＴ）在２０４ ｎｍ和２７１ ｎｍ有吸收峰，赤霉素（ＧＡ）在１９２ ｎｍ和２５２ ｎｍ有吸收峰，吲哚乙酸（ＩＡＡ）在２１８ ｎｍ和２７９ ｎｍ有吸收峰，脱落酸（ＡＢＡ）在１９４ ｎｍ和２６１ ｎｍ有吸收峰。将４种激素的混合标准液分别在以上多个波长下进行测定，发现在波长为２６２ ｎｍ下标准混合液出峰基线毛刺少且峰形较好，玉米素、吲哚乙酸

和脱落酸的峰面积为最高，赤霉素峰面积也变化较少，所以本实验采用２６２ ｎｍ为４种激素的检测波长。４种激素的吸收光谱图见图１。

２．２．３ 流动相的选择 根据４种激素的特性及植物样品所含的杂质量，通过对各种流动相如甲醇－水、乙腈－水、甲醇－乙酸－水、乙腈－乙酸－水等不同溶液系统的尝试，最终选用甲醇和０．１％冰乙酸－水溶液为流动相。经反复试验后，发现甲醇和０．１％冰乙酸－水溶液在梯度洗脱的条件下，各组分分离较好，且各峰峰型较好，分析时间也较短。４种激素保留时间合适，色谱图见图２；流动相比例见表１。

２．３ 线性关系

以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，将所得数据绘成标准曲线，玉米素线性方程为：Ｙ＝５９３．８１０Ｘ－４３．４６９，Ｒ２=０．９９９ ５，线性范围０．１４～０．３８ μｇ／ｍＬ；赤霉素线性方程为：Ｙ＝４８．９４８Ｘ－１９．１０５，Ｒ２=

０．９９９ ３，线性范围０．６７ ～１．７９ μｇ／ｍＬ；吲哚乙酸线性方程为：Ｙ＝３１５．５００Ｘ－４３．４７１，Ｒ２=０．９９９ ６，线性范围０．２５～０．６７ μｇ／ｍ

Ｌ；脱落酸线性方程为：Ｙ＝６ ４８１．０００Ｘ－１３６．６１０，Ｒ２=０．９９９ ９，线性范围０．０３６～０．０９６ μｇ／ｍＬ。结果见图３－图６。

２．４ 精密度试验

精密吸取玉米素、赤霉素、脱落酸和吲哚乙酸混合标准溶液各５．０ μＬ，重复进样５次，测定峰面积，玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脱落酸标准溶液峰面积的ＲＳＤ分别为０．３９％、０．４７％、０．２９％、０．２５％。表明方法精密度良好。

２．５ 重复性试验

同一批柑橘样品取样５份，按１．２．４操作，依法测定，计算玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脱落酸的含量，ＲＳＤ分别为３．６４％、２．４８％、２．７８％、３．１５％。表明方法重复性良好。

２．６ 回收率试验

称取已知含量的样品９份，加入玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脱落酸标准溶液５．０、

７．５、１０．０ ｍＬ各３份，按１．２．４进行操作测定，计算回收率，结果（表２-表５）表明，回收率在９８．６％～９９．１％，ＲＳＤ在０．６１％～０．９９％，表明方法回收率较好。

２．７ 样品测定结果

对柑橘样品进行分析，每批样品重复测定５次，结果取平均值，结果见表６。

３ 小结与讨论

以８０％甲醇为提取剂，冰水浴超声提取４５ ｍｉｎ，Ｃ１８柱净化为最佳实验条件，甲醇和０．１％冰乙酸为流动相，流速０．２２ ｍＬ／ｍｉｎ梯度洗脱，ＵＰＬＣ系统对样品进行测定，样品中４种激素能在７ ｍｉｎ之内达到较好的分离。充分利用了超高效液相色谱的优点与有利条件，建立的方法简单可靠，进一步拓宽了液相色谱在植物激素测定方面的应用。

参考文献：

［１］ 刘贤明，梁锦添，秦绪雄．用高效液相色谱分析植物内源激素吲哚－３－乙酸、脱落酸和玉米素［Ｊ］．色谱，１９９６，８（１）：３４０－３４１．

［２］ 陈小鹏，王秀峰，孙小镭，等．高效液相色谱测定黄瓜瓜条中赤霉素和脱落酸含量［Ｊ］．山东农业科学，２００５（１）：６５－６７．

［３］ 郑春霞，王 强，阮 晓．ＨＰＬＣ分离测定香梨三种植物激素［Ｊ］．新疆农业大学学报，２０００，２３（１）：５４－５６．

［４］ 陈波浪，郑春霞，盛建东，等． ＨＰＬＣ分离和测定棉花中３种植物激素［Ｊ］．新疆农业大学学报，２００６，２９（１）：２８－３０．