基于NMR的代谢组学方法对硝酸钕急性生物效应的研究

2021-07-06 来源：九壹网

第36卷

分析化学(FENXIHUAXUE)　研究报告第4期

2008年4月ChineseJournalofAnalyticalChemistry426～432

研究报告

基于NMR的代谢组学方法对硝酸钕急性生物效应的研究

廖沛球

1,2

　张晓宇　魏来　李伟生　吴亦洁1131

李晓晶　倪嘉缵　裴奉奎31,21,21

(中国科学院长春应用化学研究所,长春130022)　　2(中国科学院研究生院,北京100039)

(燕山大学环境与化学工程学院生物工程系,秦皇岛066004)

摘　要　采用现代核磁共振和模式识别技术,分析了腹腔注射给药2、10和50mg/kg体重剂量硝酸钕48h内

Wistar大鼠尿液和血清的核磁共振氢谱。由尿液及血清中内源性代谢物如柠檬酸、肌酸酐、N2氧三甲胺、氨基

酸、乳酸、琥珀酸、牛磺酸及葡萄糖等物种的浓度变化,结合大鼠血清指标和肝、肾组织切片图研究了轻稀土化合物Nd(NO3)3在大鼠体内的急性生物效应。结果表明,3个剂量的Nd(NO3)3主要对大鼠肝脏造成了不同程度的损伤,而且随着剂量的升高渐趋严重。同时,Nd(NO3)3也对肾脏的特定部位(肾乳头、肾小管)造成了损害。关键词　硝酸钕,体液,核磁共振,生物效应,模式识别,代谢组学

1　引　言

代谢组学这一概念是1999年由Nicholson等

[2]

[1]

提出,它是关于定量描述生物内源性代谢物质的整

体及其对内因和外因变化应答规律的科学,是系统生物学的重要组成部分。它主要利用核磁共振

(NMR)技术和模式识别方法对生物体液和组织进行系统测量和分析,从而得到生物体代谢物随时间以及生化过程变化而改变的信息。随着高场NMR技术的发展,核磁仪器分辨率和灵敏度的提高,体液1[3,4]HNMR谱的复杂性大为增加,仅靠肉眼观察很难从谱图中得到全部有效信息。模式识别(patternrecognition,PR)方法是一种成熟的多元分析方法,利用它对体液HNMR谱图数据进行处理和分析,能

得到有价值的生物信息面已取得了较好的结果

[5]

。主成分分析(principalcomponentanalysis,PCA)是最常用的PR方法之一。。

利用基于NMR技术和PR相结合的代谢组学方法在研究稀土化合物、模型毒物和药物等的急性毒性方

[6～9]

随着稀土在工业、农业和畜牧业等行业的广泛应用,稀土元素可能越来越多的通过各种途径进入生态环境和生物体内。因此,稀土对环境、生态及人类的健康所造成的近期和远期生物效应,以及稀土的

[10]

农用安全性评价已成为重要的研究课题。Nd(NO3)3是稀土微肥“常乐”的主要成分之一,本研究采用NMR技术和PR方法,分析了腹腔注射Nd(NO3)3后48h内大鼠尿液血清中内源性代谢物浓度的变化及其对大鼠肝肾组织可能造成的损伤。

2　实验部分

2.1　动物实验

选用体重(250±20)g的成年雄性Wistar大鼠20只,随机分成4组,每组5只。大鼠由白求恩医科大学实验动物部提供,严格按要求饲养,控制环境的温度、湿度及昼夜循环,并在代谢笼中适应5d后给药。对照组大鼠腹腔注射生理盐水,实验组大鼠分别腹腔注射不同剂量(Nd(NO3)32、10和50mg/kg体重)。利用代谢笼集尿装置收集给药前8h,给药后0～8、8～16、16～24、24～32、32～40和40～48h的大鼠尿液。给药48h后,将大鼠断颈处死取血,于4℃下静置1h后,以5000r/min离心分离得到血

　2007209229收稿;2007212220接受

本文系国家自然科学基金资助项目(No.20575065,20637010)3E2mail:peifk@ciac.jl.cn

第4期廖沛球等:基于NMR的代谢组学方法对硝酸钕急性生物效应的研究

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清样品。所有尿液和血清样品均于-70℃保存,供NMR测试。

2.2　体液的核磁共振检测

取0.4mL体液(尿液或血清)于离心管中,加入0.2mL缓冲溶液(0.2mol/LNa2HPO420.2mol/LNaH2PO4,pH=7.4)及0.06mLD2O,于4℃下静置10min,然后以5000r/min离心5min,取0.55mL上清液在5mmNMR样品管中于25℃进行测试。以肌酸酐(δ3.05)的甲基峰为内标。尿液和血清1

的HNMR谱图均在BrukerAv600型仪器上测试。尿液采用预饱和方法压制水峰,FID采样16次,数据点64k,延迟时间10s,90°偏转角。血清采用CPMG自旋回波序列结合预饱和方法采集信号,FID采样次数32,数据点32k,延迟时间10s,90°偏转角。采样时间均为0.911s,谱宽8992.8Hz。2.3　血清生化指标测定和组织切片照片

采用松上A26半自动生化分析仪,生化试剂由长春汇力生物技术有限公司提供。测试项目有:谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、葡萄糖(GLU),γ2谷氨酰转肽酶(γ2GT)、总蛋白(TP)和胆碱酯酶(CHE)。

肝肾组织经生理盐水冲洗,10%福尔马林溶液固定后石蜡包埋。石蜡切片机切片,H.E染色,中性树胶封固,200倍光镜下观察肝肾组织的病理改变并进行病理诊断(实验数据由白求恩医科大学应用基础医学研究所病理研究室提供)。

2.4　体液样品HNMR数据处理

采用MestreC版本软件(www.mestrec.com)及自编程序,将大鼠体液(尿液和血清)的HNMR谱按δ0.04从δ0.2～10.0分段积分。血清1HNMR谱除去水峰δ4.6～5.0,尿液1HNMR谱除去水峰δ4.4～5.0及因交叉弛豫引起峰型变宽的尿素峰δ5.0～6.0,将所产生的所有积分数据归一化,然后对余下的血清235段谱图积分及尿液的205段谱图积分分别进行主成分分析。主成分得分的统计分析采用方差分析(analysisofvariance,ANOVA)与多重比较检验。

3　结果与讨论

3.1　腹腔注射Nd(NO3)3后48h内大鼠尿液HNMR谱及其代谢组学研究

尿液是最容易得到的生物体液,它含有通过肾小球滤过,肾小管和集合管的重吸收及排泄产生的终末代谢产物。尿液的组成及其代谢物的浓度受机体各系统功能状态的直接影响,可反映机体的代谢状

[11～13]

况。因此,尿液的变化不仅反映泌尿系统的疾病,而且对其系统的疾病诊断也有重要意义。

图1为腹腔注射50mgNd(NO3)3/kg体重后不同时间段和给药前大鼠尿液HNMR谱图的比较。从图1可以看出,大鼠腹腔注射50mgNd(NO3)3/kg体重后,尿液中代谢物浓度发生了明显变化。给药

α20～8h后,柠檬酸、酮戊二酸和琥珀酸等三羧酸中间体的含量明显增加,直到给药后32～40h,柠檬

α2酸、酮戊二酸、琥珀酸含量才有所下降,但其浓度仍远高于给药前。同时,50mgNd(NO3)3/kg体重组大鼠尿液中牛磺酸含量在0～8h升高;乙酸含量在8～24h升高;苯丙氨酸、缬氨酸等氨基酸和葡萄糖含量在给药后逐渐增加,在40～48h达到最大;尿液中二甲胺(DMA),二甲基甘氨酸(DMG)和氮氧三甲胺(TMAO)尤其是TMAO含量增加;而肌酸酐(creatinine)含量在0～32h有所升高。

对于10mgNd(NO3)3/kg体重组大鼠,尿液中各代谢物种浓度变化与50mgNd(NO3)3/kg体重组

α2大致相同,给药后0～8h尿液中柠檬酸、酮戊二酸、琥珀酸和牛磺酸含量增加,随后有所降低,葡萄

糖、苯丙氨酸、缬氨酸和TMAO含量也有所升高,且在40～48h没有恢复到原来水平。其它代谢物浓度则没有明显变化。最低剂量组(2mgNd(NO3)3/kg体重)大鼠尿液中除TMAO含量上升外,柠檬酸、α2酮戊二酸和琥珀酸含量也有所增加,而其它代谢物浓度无明显变化。

α23个剂量组(2、10和50mgNd(NO3)3/kg体重)大鼠尿液中柠檬酸、酮戊二酸和琥珀酸含量都有

α2增加,且随着稀土剂量的加大而增加。柠檬酸、酮戊二酸和琥珀酸是三羧酸循环的主要中间产物。三羧酸循环是糖有氧代谢的主要途径,与催化糖的有氧分解以及蛋白质合成等有关的酶分布在线粒体基

α2质中,影响了线粒体中相关酶的活性,因而出现柠檬酸、酮戊二酸和琥珀酸代谢异常的现象。牛磺酸

[14]

和乙酸含量上升可能与大鼠肝脏受到急性损伤有关。由此可以推测,3个剂量组的

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　图1　给药前和给药50mgNd(NO3)3/kg体重后大鼠尿液1HNMR在不同时间段的比较

Fig.1　Comparisonof600MHzHNMRspectraoftheurinefromaratpredoseandpostdoseatdif2ferenttimepointsafterexposureto50mgNd(NO3)3/kgbodyweight

Nd(NO3)3都对大鼠肝脏线粒体造成了急性损伤,影响了肝脏线粒体中与三羧酸循环有关的酶的活性,

而中、高剂量(10和50mgNd(NO3)3/kg体重)组对大鼠肝脏造成的损伤则比较严重。同时,这两个中、高剂量组大鼠尿液中苯丙氨酸、缬氨酸等氨基酸和葡萄糖含量在给药后增加。这种现象可能意味着肾脏近曲小管发生了一定程度的障碍,影响了肾小管对氨基酸和葡萄糖的重吸收。50mgNd(NO3)3/kg体重剂量组大鼠尿液中DMA、DMG和TMAO含量增加是很好的肾乳头受损的NMR标志

[11]

物(markers)。

[11,15]

图2为给药各剂量Nd(NO3)3随时间变化毒性过程的主成分分析(PCA)轨迹描述。当对每个剂量组与对照组原始NMR谱图数据进行初次PCA分类后,发现2mgNd(NO3)3/kg体重和50mgNd(NO3)3/kg体重剂量组中均有一个异常样本未与同组样本归入一类。由于大鼠之间存在个体差异,

因此各组异常样本均舍弃,只取各组的另4只大鼠的每个时间段尿样HNMR谱图数据PCA分析所得得分(Score)的平均值做轨迹图。由图2a发现,2mgNd(NO3)3/kg体重剂量组在给药16～24h时间段到达离给药前(predose)时间点最远距离,而在40～48h时间段却几乎回到了给药前时间点。由此表明,从给药Nd(NO3)3后大鼠尿液代谢物浓度变化的角度,2mgNd(NO3)3/kg体重剂量对大鼠机体的损伤在48h内是可恢复的。与2mgNd(NO3)3/kg体重剂量组相比,10和50mgNd(NO3)3/kg体重剂量组大鼠尿液中内源性代谢物如苯丙氨酸、缬氨酸等氨基酸、葡萄糖和TMAO等的浓度发生了较大变化。由图2b和图2c可以看出,随时间变化毒性过程的PCA轨迹图上,两个剂量组都没有观测到明显的给药后各时间点向给药前时间点返回的迹象。从而表明,10和50mgNd(NO3)3/kg体重剂量对大鼠机体造成的损伤在48h内不可逆转。

3.2　腹腔注射Nd(NO3)348h后大鼠血清HNMR谱及其代谢组学研究

血清组成均一性高,且含有血液中几乎所有的小分子化合物。而CPMG谱使脂蛋白等生物大分子化合物少,含量低,可消除由于生物大分子NMR谱峰较宽带来的干扰,便于用NMR方法进行生理、病理的对

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照。图3为给药Nd(NO3)3不同剂量(2、10和50mg/kg体重)组和对照组大鼠血清的HNMR谱图。图4

和图5分别为对照组与各给药剂量Nd(NO3)348h后大鼠血清HNMR谱图数据的PCA分类及装载图。

图2　各给药剂量Nd(NO3)3随时间变化毒性过程的主成分分析轨迹图Fig.2　PCAmetabolictrajectoryplotofHNMRspectrafromNd(NO3)32treatedratsfromdifferenttime

interval

a.2mg/kg体重(bodyweight);b.10mg/kg体重(bodyweight);c.50mg/kg体重(bodyweight)。

　图3　对照组与不同剂量给药Nd(NO3)348h后大鼠血清1HNMR谱图比较(a)50mg/kg体重,(b)10mg/kg体重,(c)2mg/kg体重和(d)对照组

Fig.3　600MHzHNMRspectraoftheserumfrom50mg/kgbodyweightNd(NO3)32treatedrats

(a),10mg/kgbodyweightNd(NO3)32treatedrats(b),2mg/kgbodyweightNd(NO3)32treatedrats(c)andcontrol(d)

从大鼠血清HNMR谱图及其数据的PCA分析发现(图3～图5),3个剂量组样本点均与对照组清

晰分开(ANOVA,p<0.05,图4),表明给药Nd(NO3)348h后大鼠血清中的内源性代谢物含量发生了变

化。从大鼠血清HNMR谱图数据主成分装载图(图5a、b和c)判断血清中代谢物含量变化对PCA分类的贡献,可以进一步观察血清中代谢物含量的变化情况。图中信息表明,3个剂量(2,10和50mg

Nd(NO3)3/kg体重)组血清中对PCA分类贡献较大的代谢物包括葡萄糖(δ3.48,δ3.72,δ3.76,

δ3.88,δ3.92),N2乙酰糖蛋白(NAC2,δ2.12,δ2.16),乙酸(δ1.92)含量的上升以及乳酸(δ1.32,δ4.12),脂质体(δ2.76),TMAO(δ3.28),肌酸(δ3.04)及糖原(δ5.28,δ5.32)含量的降低。同时,对于中、高剂量组(10和50mgNd(NO3)3/kg体重),丙酮(δ2.24)和32羟丁酸(δ1.20)信号的上升和糖

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分析化学第36卷

　图4　腹腔注射Nd(NO3)348h后和正常大鼠血清1HNMR谱图数据主成分得分图,(a)2mg/kg体重,(b)

10mg/kg体重,(c)50mg/kg体重

1Fig.4　Principalcomponent(PC)scoresplotsfromanalysisofHNMRspectraofserumsampledat48hpostdose

from(a)2mg/kg,(b)10mg/kgand(c)50mg/kgNd(NO3)32treatedrats

　图5　腹腔注射Nd(NO3)348h后和正常大鼠血清1HNMR谱图数据主成分装载图,(a)2mg/kg体重,

(b)10mg/kg体重,(c)50mg/kg体重

Fig.5　PC1loadingsplotsfromanalysisofHNMRspectraofserumsampledat48hpostdosefrom(a)

2mg/kgNd(NO3)32treatedandcontrolrats,(b)10mg/kgNd(NO3)32treatedandcontrolrats,and(c)50mg/kgNd(NO3)32treatedandcontrolrats

蛋白(δ2.00,δ2.04),丙氨酸(δ1.48)信号的下降对PCA分类做出了贡献。

3个剂量组中大鼠血清中都出现葡萄糖含量上升,乳酸、糖原含量降低的现象,同时,中、高剂量组

还引起丙氨酸含量降低,说明Nd(NO3)3促进了肝脏的糖异生作用。当大鼠肝脏功能出现异常时,肝脏对葡萄糖的利用、肝糖原的合成、储存和转化发生障碍,从而造成糖代谢异常,血糖升高,且随着剂量的加大有增强的趋势。由于肝脏对胰高血糖素、生长激素、儿茶酚胺等有降解作用,当肝功能不全时,降解作用减退,再加上肝内分流或侧支循环的形成,使上述激素在血中浓度升高,使糖原合成减少,分解加速,糖异生作用增快,使血糖升高。而血中葡萄糖含量的上升和糖原含量的下降更是证实了该推测。血

清中含氮物质如肌酸和TMAO含量的降低,结合血清生化指标血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)(表1)的降低,说明Nd(NO3)3在48h内导致大鼠肝脏受到实质性的损伤,肝功能出现障碍。肝组织病理切片图显示,50mg/kg体重组肝脏可见微小坏死灶和门管区炎细胞轻度增多。

当大鼠给药Nd(NO3)348h后,10和50mg/kg体重剂量组均出现了丙酮和32羟基丁酸NMR信号增强的现象。脂肪酸在肝脏中经β2氧化生成的乙酰辅酶A转变为丙酮、乙酰乙酸和32羟丁酸等中间产物即酮体。丙酮和32羟丁酸的转化分别受32羟丁酸脱氢酶和乙酰乙酸脱羧酶的催化,而此两种酶存在于肝线粒体内。丙酮和32羟丁酸含量上升说明引入Nd后可能32羟丁酸脱氢酶和乙酰乙酸脱羧酶在体内代谢发生异常,造成酮体在血中的积累,超过了外周组织的正常氧化和肾脏排出的能力,从而影响了正常的生理功能。这说明10和50mg/kg体重剂量组Nd直接影响了在大鼠肝脏线粒体中进行的能量代谢。乙酸是短链脂肪酸氧化的一个产物:乙酰乙酸+乙酰辅酶A→乙酰乙酰辅酶A+乙酸,给药Nd(NO3)3后大鼠血清中的乙酸含量上升也表明在肝脏线粒体中进行的脂肪代谢发生紊乱。

给药Nd(NO3)3后48h内大鼠血清中内源性代谢物含量发生的变化表明,大鼠肝脏功能出现异常,而3个剂量(2、10和50mg/kg体重)组Nd(NO3)3主要是对大鼠肝脏造成的损伤。

第4期廖沛球等:基于NMR的代谢组学方法对硝酸钕急性生物效应的研究

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表1　腹腔注射Nd(NO3)348h后大鼠血清中的一些重要生化指标

Table1　Assessmentofimportantbiochemicalparametersofratsserumafterexposuretoneodymiumnitratefor48h

血浆

Plasma

对照数据

Control43.7±4.3288±67162±2619.3±3.06.8±1.4133±166.5±0.35.3±0.965.1±4.67.3±0.8

注射Nd(NO3)3后(mg/kgbodyweight)

Nd(NO3)3dose(mg/kgbodyweight)

1056.8±14.8248±150124±12317.5±3.55.6±1.6127.7±6.87.1±1.27.0±0.63

67.0±5.17.7±0.7

255±13.7276±40154±2117.0±1.95.9±2.0134.0±2.77.4±0.87.0±0.93

67±156.9±0.5

5049.3±5.9192±203124±3619.6±4.65.1±0.73104.7±3.637.8±0.938.6±2.43

70.4±5.25.8±0.43

谷丙转氨酶Alanineaminotransferase(ALT)(IU/L)

碱性磷酸酶Alkalinephosphatase(ALP)(IU/L)

天门冬氨酸转氨酶Aspartateaminotransferase(AST)

(IU/L)

白蛋白Albumin(ALB)(g/L)

尿素氮Ureanitrogen(BUN)(mmol/L)肌酸酐Creatinine(Cr)(μmol/L)葡萄糖Glucose(GLU)(mmol/L)γ2谷氨酰转肽酶γ2Glutaminetransferase(γ2GT)(IU/L)总蛋白Totalprotein(TP)(g/L)

胆碱酯酶Cholineesterase(CHE)(U/mL)

　3:显著性检验(t2test),P<0.05;33:显著性检验(t2test),P<0.005。

3.3　大鼠血清中一些重要的生化指标及组织切片光镜图分析中、高剂量组(10和50mg/kg体重)血清中一些重要的生化指标发生了明显的变化,例如葡萄糖(GLU)和γ2谷氨酰转肽酶(γ2GT)的升高以及碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和胆碱酯酶(CHE)的降低,而低剂量组(2mg/kg体重)(见表1)只有尿素氮的降低

γ2以及葡萄糖、谷氨酰转肽酶的升高比较明显,可见3个剂量组血清中生化指标的变化存在着剂量2浓

113+

度关系。血清中葡萄糖含量的上升与其HNMR谱及HNMR谱的PCA分析结果是一致的,说明Nd的引入导致肝脏功能出现异常,糖异生作用增强。血清中γ2GT主要来自肝脏,具有较强的特异性。肝胆系统病变的时候,γ2GT活性升高。尿素氮和肌酐的降低应该和血清中TMAO、肌酸等含氮物质的降低一样预示着硝酸钕造成了肝脏的损伤。而碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶和胆碱酯等重要的生化指标不是表现出上升而是下降,这可能与硝酸钕造成的肝脏特异性损伤有关。肾组织切片图显示,中、高剂量组可见肾小管上皮细胞肿胀、红染,有的出现肾小管管腔内管型,低剂量组可见肾脏间质较多炎细胞浸润。而肝组织切片图中,中、低剂量组的肝脏基本正常或肝细胞略显疏松,高剂量组可见微小坏死灶和门管区炎细胞轻度增多。

通过以上的分析发现,Nd(NO3)3主要造成了大鼠肝脏的损伤。同时尿液中代谢物的浓度变化显示,大鼠肾脏特定部位(肾小管、肾乳头)也受到了损伤,可能是由于Nd(NO3)3对大鼠肝脏的损伤随着剂量的增加而渐趋严重,从而使得大鼠肾脏功能受到了损害。轻稀土Nd与轻稀土La、Ce的生物效[3,4,9,16]应相比,Nd与Ce的生物效应更相似,两者都对大鼠的肝脏和肾脏造成了损伤,它们的高剂量组都引起了大鼠尿液中肾乳头损伤标志物如二甲胺、二甲基甘氨酸和TMAO含量的上升。而La则主要是对大鼠肝脏造成损伤,对肾脏的损害不太明显。而Nd(NO3)3和Ce(NO3)3的安全剂量都应低于2mg/kg体重,可见轻稀土Nd和Ce的急性毒性比较相似。References

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分析化学第36卷

7　WuHui2Feng(吴惠丰),ZhangXiao2Yu(张晓宇),LiXiao2Jing(李晓晶),LiaoPei2Qiu(廖沛球),LiWei2Sheng

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StudiesontheAcuteBiochemicalEffectsofNd(NO3)3by

NuclearMagneticResonance2basedMetabonomics

LiaoPei2Qiu

1,2

,ZhangXiao2Yu,WeiLai,LiWei2Sheng,WuYi2Jie,LiXiao2Jing,NiJia2Zuan,PeiFeng2Kui

31,21,21

(ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022)

(GraduateSchooloftheChineseAcademyofSciences,Beijing100039)

YanshanUniversity,Qinhuangdao066004)

(DepartmentofBiologicalEngineeringCollegeofEnvironment&ChemicalEngineering,

Abstract　ThebiochemicaleffectsofNd(NO3)3wasstudiedbyNMR2basedmetabonomics.MaleWistarratswereadministratedintraperitoneallywithNd(NO3)3atdosesof2,10and50mg/kgbodyweight.Urinewascollectedovera482hperiodafterdosingandserumwascollectedafter48h.HNMRspectraofbiofluids(urineandserum)wereanalyzedbypatternrecognitionusingprincipalcomponentsanalysis.Thestudies

showedthattherewasadose2relatedbiochemicaleffectsofNd(NO3)3treatment.Theliverandkidney(renaltubularandrenalpapilla)damageinducedbyNd(NO3)3wascharacterizedbythevariationsofmanyendoge2nousmetabolites,suchascitrate,creatinine,N2trimethyldioxide,dimethylamine,dimethylglycine,lactate,taurineandglucose.TheNMR2basedmetabonomicscanbeappliedtostudythebiochemicaleffectsortoxici2tiesofothercompounds.

Keywords　Neodymiumnitrate,biofluids,nuclearmagneticresonance,biochemicaleffects,patternrecogni2tion,metabonomics

(Received29September2007;accepted20December2007)

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