miR-150在肺癌细胞中表达变化及其对细胞增殖能力的影响和机制

张靖雯，孙亚娇，王东，陈复辉和机制（哈尔滨医科大学附属第二医院,哈尔滨150086）摘要：目的 观察微小RNA-150（miR-150）在肺癌细胞中的表达变化，并探讨其对肺癌细胞增殖的影响及作用

机制。方法 常规培养肺癌细胞A549、人 皮细胞16HBE,qRT-PCR法检测细胞中的miR-150。将A549细分为抑表达组、促表达组和对照组，抑表达组、促表达组经脂质体分别转染miR-150抑制物、模拟物;转染48

h后，采用qRT-PCR法检测各组细胞中的miR-150验证转染效果,MTS法检测细胞增殖活力，平板克隆实验检测细

胞克隆形成能力，流式细胞仪检测细胞周期，qRT-PCR、Western blotting法分别检测细胞中的c-Myc.Cyclin D1

mRNA及蛋白。结果 A549细胞中miR-150相对表达量为10.21 ±0.06,高于16HBE细胞的1.00 ±0. 10（P <

0. 05） ；miR-150相对表达量促表达组 > 对照组 > 抑表达组（P均<0.05）;与对照组比较，抑表达组细胞增殖OD490

值下降，促表达组 殖OD490值增高（P <0.05或<0.01）细胞克隆形成数目促表达组 > 对照组 > 抑 达组（P<0.05）;与对照组比较，抑表达组&期细胞比例增多，促表达组G2期细胞比例增多（P均<0.05）与对照组比

较，抑表达组c-Myc、Cyclin D1 mRNA及蛋白相对表达量下降，促表达组c-Myc、Cyclin D1 mRNA及蛋白增加（P均

<0.05） o结论 肺癌A549细胞miR-150表达增加;miR-150可能通过上调c-Myc、Cyclin D1表达促进细胞周期的

进程， 强肺癌 的增殖能力。关键词:肺癌;A549细胞;微小RNA-150;细胞增殖;细胞周期;细胞克隆;c-Myc蛋白;Cyclin D1 蛋白doi： 10. 3969/j. issn. 1002-266X. 2019. 26. 002中图分类号:R734.2 文献标志码:A 文章编号：1002-266X（ 2019） 26-0005-04开放科学（资源服务）

标识码QSID）Expression changes of miR-150 in lung cancer cells and its effect on proliferation

of lung cancer cellsZHANG Jingwen,, SUN Yajiao , WANG DongCHEN Fuhui(The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086 , China )Abstract: Objective To observe the expression changes of microRNA-150 ( miR-150) in lung cancer cells, and to

, explore its effect on the proliferation of lung cancer cells and its mechanism. Methods The lung cancer cells A549 and

human lung normal epithelial cells 16HBE were routinely cultured, and the expression of miR-150 in cells was detected by

qRT-PCR. A549 cells were randomly divided into the expression-inhibited group (inhibition group) , pro-expression group,

and control group. The inhibition group and the pro-expression group were transfected with miR-150 inhibitor and mimics

by liposome，respectively. After transfection for 48 h，qRT-PCR was used to detect the expression of miR-150 in each

group to verify the transfection effect. The cell proliferation was detected by MTS assay. The cell clone formation ability was

detected by plate cloning assay. The cell cycle was detected by flow cytometry. The mRNA and protein expression of c-Myc and Cyclin D1 in cells were detected by qRT-PCR and Western blotting, respectively. Results The relative expression of miR-150 in A549 cells was 10. 21 ± 0. 06，which was higher than that in 16HBE cells ( 1. 00 ± 0. 10)( P < 0. 05) . The

relative expression of miR-150 was in the following order，the pro-expression group > control group > inhibition group ( P <

0. 05 ). Compared with the control group, the OD490 value of the cell proliferation decreased in the inhibition group, and the

OD490 value of the cell proliferation increased in the pro-expression group ( P < 0. 05 or P <0. 01) ; the number of cell clone

formation was in the following order, the pro-expression group > the control group > the inhibition group ( P < 0. 05) . Com-

基金项目：国家科技重大专项项目(2017ZX10103004-009)。第一作者简介:张靖雯(1990-)，女，硕士研究生，主要研究方向为肺部肿瘤。E-mail: shaokaolv@163.com通信作者简介：陈复辉(1967-)女,博士， , 为呼 病。E-mail： czm20161314@163.com

5山东医药2019年第59卷第26期pared with the control group, the proportion of cells in the G] phase of the inhibition group increased, and the proportion of cells in the G2 phase of the pro-expression group increased ( both P <0.05). Compared with the control group, the mRAN

and protein expression of c-Myc and Cyclin D1 in the inhibition group decreased, and the mRNA and protein expression of

c-Myc and Cyclin D1 increased in the pro-expression group ( both P <0.05). Conclusion The expression of miR-150 in­

creases in lung cancer A549 cells; miR-150 may promote the cell cycle progression by up-regulating the expression of c-

Myc and Cyclin D1 ,and thus enhance the proliferation of lung cancer cells.Key words: lung carcinoma ； A549 cells; microRNA-150; cell proliferation ； cell cycle; cell cloning ； c-Myc protein ；

Cyclin D1 protein肺癌是最常见的恶性肿瘤,在全球癌症相关死 因中位居第一⑴。目前，虽然许多分子靶点已经确

为抑表达组、促表达组和对照组男抑表达组、促表达

组按说明书将脂质体2000分别与miR-150抑制物、 定可以改善肺癌的治疗疗效，但患者5年总生存率 仍约为16% ［］。因此,进一步寻找肺癌发生发展新

的分子机制男寸肺癌患者的治疗及生存质量提高具 有重要意义。微小RNA (miRNA )是一类由19 ~25

个核昔酸构成的小分子非编码单链RNA,其通过结

合靶基因mRNA的3'非翻译区，调控基因转录后表 达水平［］，在肿瘤细胞增殖、凋亡及其他生物过程

中起关键作用⑷。研究报道,miR-150在肺癌组织

中高表达，且高表达患者预后较差［5］,并可以通过

调控上皮间质转化(EMT)促进肺癌的侵袭和转 移［6］,但其在肺癌增殖中的作用及机制尚未明确。 2017年1月~2018年10月，我们以肺癌细胞株

A549为研究对象，观察miR-150在肺癌细胞增殖中 的作用，为开发肺癌基因治疗新靶标提供实验数据。 1材料与方法1.1主要材料人肺癌细胞A549、人肺正常上皮

细胞16HBE均购自美国ATCC细胞库，DMEM-F12 培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美 国Gibco公司；MTS细胞增殖及细胞周期检测试剂 盒、蛋白裂解试剂均购自南京凯基生物技术有限公

司,逆转录试剂盒、SYBR实时荧光定量聚合酶链反 应(qRT-PCR)试剂盒等均购自日本TaKaRa公司。 miR-150抑制物、miR-150模拟物(mimics )、内参

GAPDH和c-Myc,Cyclin D1的引物由上海捷瑞生物

工程有限公司设计合成男旨质体2000、TRIzol均购 自美国Invitrogen公司；兔抗人c-Myc抗 体

(ab39688)、兔抗人 Cyclin D1 抗体(ab134175 )、鼠

抗人GAPDH抗体(ab8245)及BCA试剂盒购自美 Thermo 公 。1.2实验方法1.2.1细胞培养与分组转染 将细胞培养在37

七、5% CO2全湿度培养箱中，A549细胞培养基为10% FBS 的 DMEM-F12，16HBE 培养 为 10% FBS 的 RPMI1640。 A549

对数生长期时，将细胞铺至6孔板;贴壁24 h后将细胞分

6miR-150 mimics转染至细胞，对照组不转染，置于培

养 培养 48 h。1.2.2 miR-150表达检测 采用qRT-PCR法。设计miR150 物 为 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTC- CGAGGTA-3'、下游为 5'-TTCGCA GATACGACCACTGG-

3', GAPDH 引物上游为 5'-ACAACTTTGGTATCGTG- GAAGG-3'、 下 为 5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。

取A549、16HBE细胞及各组转染细胞，采用TRIzol法

裂解细胞提取总RNAo将RNA逆转录成cDNA,以

GAPDH为内参基因进行荧光定量PCRo每个样品设

置3个反应复孔，按两步法进行反应，分析各样品的循 环阈值(Ct),用2-AACt法分析miR-150相对表达量。重

复实 3 。1.2.3

A549细胞增殖能力观察 采用MTS法。

取各组细胞，以2x103/孔、150 培养基接种于96

孔板,每组设6个平行复孔,置于培养箱中培养;分

别在铺板后24、48、72 h时，各孔加入MTS工作液

30 ^L;培养箱中孵育2 h后，扫描酶标仪490 nm波

长处测取光密度(0D)值。0D值越高提示存活细 胞数越多男田胞相对增殖能力越强。重复实验3次。1.2.4 A549细胞克隆形成能力观察 采用平板克

隆形成实验。取各组细胞，以3 x102/孔、2 mL培养 基接种于6孔板,每组设3个平行复孔，置于培养箱 中培养;培养1周时，各组转染试剂重复加入各组孔

中1次，继续培养1周;弃掉培养基,PBS洗3次，加 1 mL甲醇固定15 min;晾干后加入1 mL苏木素染 色30 min,双蒸水冲洗后晾干;扫描拍照，计数肉眼克隆 。 复实 3 。1.2.5 A549细胞周期检测 采用流式细胞术。取

各组细胞，以1 x 106/管接种3管；PBS洗3次后，以

预冷的70%乙醇固定24 h；PBS洗2次后男廿入500

咽的PI染色工作液(12. 5咽的PI储存液男 咲

的RNase储存液)，混匀后37 °C温箱中避光孵育30

mino PBS洗1次后，上流式细胞仪检测各周期细胞

比例。重复实验3次。山东医药2019年第59卷第26期1.2.6

A549 细胞中 c-Myc、Cyclin D1 mRNA 检测

（60. 68 ± 9. 49）、、286. 58 ± 15. 90） （167. 15 ± 11.37）个,细胞克隆形成数目促表达组 > 对照组>

采用qRT-PCR法。设计c-Myc引物上游为5'-TCCCTCCACTCGGAAGGAC-3'、下游为 5'-CTGGTG- CATTTTCGGTTGTTG-3', Cyclin D1 引物上游为 5'-

抑表达组（P均<0.05）。2. 5 各组 A549

期比较

细胞周期G1期2。TGGAGCCCGTGAAAAAGAGC-3'、下游为 5'-TCTC- CTTCATCTTAGAGGCCAC-3'。取各组细胞，qRT- PCR 法同1.2.2,按说明书操作，用2-AACt法分析c-

组表2 各组A549细胞各周期细胞比例比较％珔±s（，）S期G2 期Myc,Cyclin D1 mRNA相对表达量。重复实验3次。抑 达组达组对照组63.57 ±1.01#21.87 ±1.2113.04±2.6315.95 ±0.6533.13 ±1.29#54.83 ±3.9150.83 ±3.561.2.7 A549 细胞中 c-Myc,Cyclin D1 蛋白检测

28.89 ±2.3121. 01 ± 0. 70采用Western blotting法。取各组细胞，加入500

注:与对照组比较P <0.05，o»L/孔的蛋白裂解液（含5 p,L的蛋白酶抑制剂和5的磷酸酶抑制剂），超声裂解30 min;4 下以12 ,000 r/min离心30 min,将上清转移至新的,EP管

中BCA试剂盒测蛋白浓度;煮沸变性后每孔加50

隅蛋白行SDS-PAGE电泳；经湿转将蛋白转移至 PVDF膜，8%脱脂牛奶封闭3 h；加入GAPDH、c-

Myc,Cyclin D1 一抗,4 °C 孵育过夜；TBST 洗 3 次

后，加入二抗孵育室温孵育2 h；ECL化学发光法曝 光条带，扫描拍照。采用Quantity One V4软件分析 蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH蛋白

条带灰度比值表示目的蛋白表达量。重复实验

3。1.3 统计学方法 采用SPSS17. 0统计软件。计量资料以x± s表示，多组间比较行单因素方差分 析,两组间比较行LSD-t检验。P <0.05为差异有

计。2结果2.1

A549、16HBE 细胞 miR-150 表达比较 A549

细胞中miR-150相对表达量为10.21 ±0.06,高于 16HBE 细胞的 1.00 ±0.10（P <0.05）。2.2 A549细胞转染后miR-150表达比较 抑表达

组、 达组和对照组 miR-150 对 达量分 为 0.18 ±0.09,9.43 ±0.24、1.00 ±0. 10,miR-150 相

对表达量促表达组 > 对照组 > 抑表达组（P均<

0.05 ）o说明miR-150抑制物和模拟物作用较强，可

继续后续的功能实验。2.3各组A549细胞增殖能力比较 见表1。表1各组A549细胞增殖OD490值比较（丘±s）细胞增殖OD490值组24 h48 h72 h抑表达组0.216±0.012 *0.350 ±0.043#0.507 ±0.050#促表达组0.685 ±0.144 *0.996 ±0.153#1.503 ±0.012#对照组0.391 ±0.1010.708 ±0.1490.899±0.135注:与对照组比较，P <0.05,#P <0.01o2.4各组A549细胞克隆形成能力比较 抑表达 组、促表达组合对照组细胞克隆形成数目分别为2. 6 各组 A549 细胞中 c-Myc,Cyclin D1 mRNA 及

蛋白 达比较 3。表 3 各组 A549 细胞中 c-Myc、Cyclin DI mRNA及蛋白表达比较（珔±s）组c-MycCyclin D1mRNA蛋白mRNA蛋白抑 达组0.30 ±0.101.23±0.250.37 ±0.060.73 ±0.15达组7.90 ±0.663.53 ±0.315.50 ±0.504.20 ±0.36对照组1.00±0.102.10±0.361.00±0.101.60±0.203讨论随着医学技术的不断进步，虽然人们在蛋白及

基因分子水平对肺癌的发病机制有了新的认识，以

及肺癌的手术、放化疗及靶向药物等联合治疗的应 用，但肺癌的早期诊断率和预后并没有好转的趋 势⑺刃。目前，肺癌的发病机制尚未完全明确。因 此，研究新的候选癌基因有望成为提高肺癌诊断及

改善预后的关键。miRNA作为高度保守的一类小 分子非编码单链RNA,在多种信号通路中发挥重要 作用\"叫 研究发现,miRNA在多种肿瘤组织中表

达异常，可作为肿瘤诊断的早期指标,并且与患者的

预后密切相关;因其具备癌基因和抑癌基因的作用,

还可作为肿瘤治疗的潜在靶点［11，12］。miR-150因在正常造血作用中具有重要的调节 作用而被较早鉴定出来［13］。Dezhong等［14］在前列

腺癌组织中观察到miR-150表达上调，并与肿瘤的 复发转移呈正相关;周毅波等［15］研究发现,miR-150

通过 调其 因 Nanog 癌 的 殖与侵袭。而最近研究也发现,miR-150高表达与非 小细胞肺癌的侵袭和迁移有关［16］，但miR-150高表 达与肺癌增殖的关系尚不清楚。本研究发现‘miR-

150 在A549中表达高于16HBE,采用miR-150抑制

物和 mimics 转染 A549 一 miR-150 在肺癌细胞中发挥的作用;转染miR-150抑制物后细

miR-150 达 , 功能实

殖能力和平板克隆形成能力下降;转染miR-150 mimics 后细胞中miR-150表达增多，功能实验显示细胞增

山东医药2019年第59卷第26期殖能力和平板克隆形成能力增强。上述结果提示，

高表达miR-150可促进肺癌细胞增殖。肿瘤为一类细胞周期紊乱性疾病，大部分癌基 因与抑癌基因发挥作用的最终效应都会汇集到细胞

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促进肺癌细胞增殖的作用机制,我们进一步采用流 式细胞仪检测细胞转染miR-150抑制物和mimics 后细胞周期的变化;结果显不,转染miR-150抑制物 后G1期细胞比例增多，表明细胞周期明显阻滞在

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G1期;转染miR-150 mimics后G?期细胞比例增多，

表明细胞周期明显阻滞在G2期。这提示细胞中 miR-150表达减少,使细胞阻滞在G1期而不能进入

到S期、G2期以及细胞有丝分裂期,成功地抑制了

细胞增殖;而细胞中miR-150表达增多，使细胞阻滞 在G2期而不能进入到细胞有丝分裂期，抑制了细胞

增殖，与本研究miR-150表达增多促进细胞增殖现

象是相矛盾的。研究发现,G2细胞周期的停滞可能

存在肿瘤发展的早期阶段,G2期细胞增多是由于c-

Myc基因表达增多，导致G2期阻滞的细胞变成非整

倍体男卩核内复制陀]。因此，考虑miR-510增多导

致的G2期细胞增多可能是c-Myc基因的表达增多 引起的，最终导致的结果是促进细胞增殖。c-Myc是调节细胞增殖、迁移和血管生成的癌 基因[19]，可作为转录因子异位至细胞核发挥作用；

其靶基因较多，而与细胞周期有关的细胞周期蛋白

Cyclin D1即为其中之一。本研究结果显示,与对照

组比较，抑表达组c-MycCyclin D1 mRNA及蛋白相 对表达量下降，促表达组c-MycCyclin D1 mRNA及

蛋白 。 c-Myc 和 Cyclin D1 达水平与miR-150表达水平一致，表明miR-150可能

通过促进c-Myc和其靶基因Cyclin D1的表达促进

癌 的 殖。综上所述男市癌A549细胞miR-150表达增加； miR-150可能通过上调c-MycCyclin D1表达促进

细胞周期的进程，进而增强肺癌细胞的增殖能力。

因此,miR-150是肺癌A549细胞活化增殖潜在的靶

向分子，可为干预和预防肺癌提供实验室数据和新

的思路。参考文献：[1 ] Siegel RL, Miller KD. Cancer statistics, 2018 [J]. CA Cancer J

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