•论著•
氯沙坦对慢性心力衰竭患者外周血内皮祖细胞的影响研究
陈菊明、左琦
【摘要】
一
2，宋艳玲、
麦华德、纪新博、王雅纯、林芸芸、顾申红
1
目的探讨氯沙坦对慢性心力衰竭患者外周血内皮祖细胞（EPCs)的影响。方法选取2015年3月
2016年3月海南医学院第一附属医院心内科收治的慢性心力衰竭患者30例，采集患者外周血10 ml,体外培养
EPCs。将体外培养的EPCs随机分为A组，B组和C组，每组10份。A组不做任何处理，B组采用氯沙坦lOpmol/L 进行处理，C组采用氯沙坦10IJUI1O1/L +磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K)抑制剂lOpmol/L进行处理。比较3组EPCs培 养12h、24h、36h、48h、72h 535nm波长下光密度值（OD535 ),穿膜细胞数，苏氨酸蛋白激酶（Akt)及内皮型一 氧化氮合酶（eNOS)蛋白表达量。结果时间与方法在OD535上存在交互作用（P<0.05);时间在OD535上主效应显著 (尸 <0.05);方法在 OD535 上主效应显著（P<0.05); B 组EPCs 12 h、24 h、36 h、48 h、72 h OD535 高于 A组、C 组 (尸<0.05)。B组EPCs穿膜细胞数多于A组、C组（P <0.05)。B组EPCs的Akt和eNOS蛋白表达量高于A、C组 (P <0.05)。结论氯沙坦可有效促进慢性心力衰竭患者外周血EPCs增殖和迁移，改善内皮细胞功能，其可能通过调 节PDK/Akt/eNOS信号通路而发挥作用。
【关键词】 心力衰竭；氯沙坦；内皮祖细胞【中图分类号】R 541. 6 杂志，2017，
【文献标识码】A
DOI: 10. 3969/j.issn. 1008 -5971.2017.08.010
陈菊明，左琦，宋艳玲，等.氯沙坦对慢性心力衰竭患者外周血内皮祖细胞的影响研究[J].实用心脑肺血管病
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Impact of Losartan on Peripheral Blood Endothelial Progenitor Cells in Patients with Chronic Heart Failure CHEN Ju -ming , ZUO Qi2, SONG Yan - ling1 , MAI Hua - de1 , JI Xin - bo1 , WANG Ya - chun , LIN Yun -yun , GU Shen - hong11. Department of Gerontology, the First Affiliated Hospital of Hainan Medical College，Haikou 570102, China2. Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102 , China Corresponding author： GU Shen-hong, E-mail： 1514063110@ qq. com
【Abstract】 Objective To investigate the impact of losartan on peripheral blood endothelial progenitor cells in patients with chronic heart failure. Methods From March 2015 to March 2016, a total of 30 patients with chronic heart failure were selected in the Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Hainan Medical College, 10 ml peripheral blood was collected from each case and endothelial progenitor cells were cultured in vitro. Cultured endothelial progenitor cells were divided into A group, B group and C group, each of 10 samples. Endothelial progenitor cells of A group did not received any intervention, endothelial progenitor cells of B group received losartan (10 jjimol/L) , while endothelial progenitor cells of B group received losartan (10 jjimol/L) combined with PI3K inhibitor (10 jjimol/L). OD535 of endothelial progenitor cells after 12 hours, 24 hours, 36 hours, 48 hours and 72 hours of culture, number of transmembrane cells, protein expressions of Akt and eNOS were compared among the three groups. Results There was interaction between time and method in 〇D535 of endothelial progenitor cells ( P < 0. 05 ) ； main effects of time and method were significant in 〇D535 of endothelial progenitor cells (P < 0. 05 ) ； OD535 of endothelial progenitor cells of B group was statistically significantly higher than that of A group and C group after 12 hours, 24 hours, 36 hours, 48 hours and 72 hours of culture, respectively (P < 0. 05 ). Number of transmembrane cells of B group was statistically significantly more than that of A group and C group, respectively ( P < 0. 05 ). Protein expressions of Akt and eNOS of B group were statistically significantly higher than those of A group and C group (P < 0. 05 ).
基金项目：海南省自然科学基金项目（814355);国家自然科学基金资助项目（81560054)
1.570102海南省海口市，海南医学院第一附属医院老年病科 2. 570102海南省海口市，海南医学院第一附属医院心内科 通信作者：顾申红，E-mail: 1574063710@qq.com
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Conclusion Losartan can effectively promote the proliferation and migration of peripheral blood endothelial progenitor cells in
patients with chronic heart failure, is helpful to improve the endothelial cell function, losartan may play a role through adjusting PI3K/Akt/eNOS signal pathway.
[Keywords】 Heart failure; Losartan; Endothelial progenitor cells
内皮祖细胞（EPCs)可参与血管生成，在缺血性 疾病、血管创伤后愈合、预防血管狭窄中具有较好的应 用前景[1]。研究表明，EPCs是反映慢性心力衰竭的生 物标志物，因此提高EPCs的释放可有效改善慢性心力 衰竭患者心功能[2]。研究表明，血管紧张素n受体抬抗 « = 10):采用氯沙坦10 |xmd/L处理；磷脂酰肌醇3 - 激酶（H3K)抑制剂组（C组，《=10):采用氯沙坦 10 |xmol/L + PI3K 抑制剂 10 |xmol/L 处理。1.4观察指标
（1) EPCs增殖情况：将3组EPCs接
种于人纤维连结蛋白包被的96孔培养板中，每孔加人 剂（ARBs)具有调节EPCs的作用[3]。氯沙坦是ARBs 类药物，可减轻左心室肥厚，抑制心肌细胞增生，延迟 或逆转心肌重构，改善左心室功能，同时可增加慢性心 力衰竭患者外周血EPCs,改善血管内皮细胞功能。近 年来，临床有关EPCs与慢性心力衰竭的关系研究报道 逐渐增多[4_5]。本研究旨在探讨氯沙坦对慢性心力衰竭 患者外周血EPCs的影响，现报道如下。1
资料与方法
1.1 一般资料选取2015年3月一2016年3月海南医学院第一附属医院心内科收治的慢性心力衰竭患者30 例，均符合第8版《内科学》中的慢性心力衰竭诊断标 准。排除标准：（1)合并肝、肾功能不全者；（2)存 在恶性肿瘤者；（3)妊娠期或哺乳期妇女。本研究经 医院医学伦理委员会审核批准，患者及其家属均签署知 情同意书。
1.2药物与实验试剂氯沙坦（商品名：科素亚；生 产厂家：杭州默沙东制药有限公司；批准文号： 20161105;规格：50 mg/片）；PI3K抑制剂（商品名： NVP-BEZ235;生产厂家：美国Selleck公司；批准文 号：20160324)。M-199培养基、胎牛血清、胰蛋白 酶、青霉素和链霉素双抗购自美国Gibco公司；兔抗人 一抗（抗苏氨酸蛋白激酶、抗内皮型一氧化氮合酶）、 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗、增强化学发光法 (ECL)显色试剂盒购自美国Santa Cmz公司；噻哇蓝购 自美国Sigma公司。1.3方法
1. 3. 1 EPCs培养采集30例患者外周血10 ml,采用 Flc〇ll密度梯度离心法收集外周血单个核细胞；将单个 核细胞接种于人纤维连结蛋白包被的6孔培养板中，每 孔加人M - 199培养液（10%胎牛血清+ 100 U/ml链霉 素+ 100 u/ml青霉素）1 ml;置于37 〇C，5% C02的培 养箱中培养，隔天更换培养液。
1.3.2分组将体外培养的EPCs随机分为3组，空白 组（A组，ra = 10):不经任何处理；氯沙坦组（B组，
M -199培养液（10%胎牛血清+ 100 U/ml链霉素+ 100|Xg/ml青霉素）lml及血管内皮生长因子（VEGF) 50ng/ml;置于37 〇C，5% 0)2培养箱中培养，3 d后 更换培养液，后每隔2 d更换1次；待EPCs铺满80% 以上后加人噻哇蓝10 1x1，置于培养箱孵育4 h，吸弃培 养液上清，加人二甲基亚砜（DMS0) 100 |xl，振摇10 min，采用美国Bio - Rad公司生产的iMark680型全自动 酶标仪于535 nm波长下测定各孔培养12 h、24 h、36 h、48h、72h光密度值（0D)d (2) EPCs迁移情况： 将3组EPCs细胞悬浮于培养液200 |xl，后接种于 Boyden chamber,下室加人培养液 600 |xl + VEGF 50 ng/ ml +基质细胞趋化因子-1 (SDF-1) 100ng/ml;培养 24 h后取出滤膜，刮去上室未迁移细胞，用10%甲醇 固定，Giemsa染色，随机选取6个显微视野（X200) 计数迁移到底层的细胞数目。（3) EPCs苏氨酸蛋白激 酶（Akt)和内皮型一氧化氮合酶（eNOS)蛋白表达 量：采用RIPA裂解液裂解3组EPCs,离心提取细胞总 蛋白，二喹啉甲酸（BCA)法测定蛋白浓度；等量总蛋 白上样，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)分离后转至硝酸纤维素膜上；用5%脱脂 奶粉的TBS - T室温封闭1 h，加人Akt ( 1: 500)，eNOS (1:500) —抗4 °C孵育过夜，加人辣根过氧化物酶标记 的羊抗兔（1: 2〇 〇〇〇)二抗孵育1 h，TBS-T漂洗3 次，ECL显色，使用B1〇 - Rad扫描分析，并计算目的 蛋白相对表达量〔蛋白相对表达量=〇D目的蛋白/0D 内参（P-actm)〕。上述检测均进行5次，检测结果取平 均值。
1.5统计学方法采用SPSS 19.0统计学软件进行数据 处理，计量资料以（I±4表示，重复测量数据采用重 复测量方差分析，多组比较采用单因素方差分析，两两 比较采用9检验。以P <〇.〇5为差异有统计学意义。2 结果
2.1 EPCs增殖时间与方法在OD535上存在交互作用 (P<0.05);时间在OD535上主效应显著<0.05);
实用心脑肺血管病杂志施7年8月第25卷第8期投稿网址•• http.: //www, ayxnH net
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方法在〇D53Si；主效应显著（P<0.05); B组EPCS 12
h、24 h、36 h、48 h、72 h OD53S高于 A 组、C 组，差异
eNOS蛋自表达量比较，差异有统计学意义（尸<
0• 05 ) ; B 组 EPCs 的 Akt 和 eNOS 蛋 T丨及达敁 AT. A、C 组，羞异有统计学意义（P<〇.〇5,见表2、图3)。
表
有统计学意义（尸<〇.〇5,见表1、图1)。
表
1 3组
EPCs不同时间点0DS3S比较
2 3组
EPCs的Akt和eNOS鸾白表读量比较（If ± s)
Table 1 Comparison of OD535 of EPCs among the three groups at different
Table 2 Comparison of protein expressions of Akt and eNOS protein among
time points
til m12 h24 h36 h48 h72 hAM1
00.22±0.02a0.47±0.04a0.91±0.03aU5±0.04a1.28±0.03aBfi100.50 ±0.060.84 ±0.041.53 ±0.061.84 ±0.052.02 ±0.06
100.25±0.03a0.57±0.05a0.88±0.06a1.26±0.05a1.37±0.05a
F值
F 时间=69.641组间=41.317交互=23.656Z5值
P 时间 < 〇•
^ 组间 < 〇•
^ 交互 < 〇•
注：与
B组比较，aP <0.05
Figure 1 OD535 of EPCs of the three groups at different time points
2.2
EPCs迁移 A组EPCs穿膜细胞数为（15.5
± l.7)个，B组EPCs穿膜细胞数为（33.8 ±2. 9)个， C组EPCs穿膜细胞数为（IX 5 ±2.0)个$ 3组EPCs
穿膜细胞数比较，差异有统计学意义（F = 197. 580, P
<0.05); B组
EPCs穿膜细胞数多于A组、C组，差异
有统计学意义（《值分别为25. 625、22. 825 , P < 0• 05 , 见图2)。
A组
B组 C组
图
2 3粗EPCs穿膜儈况（Gfcmsa染色，x200)
Figure 2 Transmembrane cells of the three groups
2.3 Akt和eNOS蛋自表达量 3组EPCs的Akt和
the three groups
组别A份数
AkteNOS组B100.91 ±0. 03\"0.88 ±0.03a组101.37 ±0.081.26 ±0.06
C组100.98 ±0.07a0.82±0.06a
續
75.533105.432pH
<0. 05<0. 05注：
组比较，〒<0.〇5;
Akt =苏氨酸蛋自激酶，eN0S =内皮
型一寧■化氮合酶
Figure 3 Protein expressions of Akt and eNOS of the three groups
3
讨论
EPCs是血管内皮细胞的前体细胞，可通过动员、
迁移、..归.巢和分化4步骤而修复内皮细胞功能损伤，减 少氧化应激或细胞凋亡。1997年ASAHARA等》]诳明外 周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞，并将其 命名为血管EPCSq新生血管中约25%内皮细胞由EPCs 分化而来，且其可在损伤部位黏附、聚集、增殖、分化 形成新的血管内皮细胞[7<。因此，EPCs具有修复内 皮细胞功能，促进内皮细胞分化、血管再生，延缓动脉 粥样硬化形成的作用[4]。另外，EPCs还能抑制氧化应 激，促进一氧化氮（NO)生成，可在缺血或肾素-血 管紧张素-醛固酮系统（RAAS)激活状态下增强内皮 细胞功能，进而保护心肌细胞
慢性心力衰竭患者常伴有RAAS和内皮细胞功能损 伤，临床常采用ARBs类药物治疗。研究表明，ARBs 通过抑制RAAS而有效阻断血管紧张素n受体活性，降 低心血管疾病发生率、病死率和致残率[K]。
MATSUURA等[13]研究表明，ARBs可有效阻断血管紧张
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素n介导的氧化应激、炎性反应和胰岛素抵抗等对 EPCs的影响。
¥八0等[14]研究表明，氯沙坦可促进EPCs增殖、迁 移。本研究结果显示，B组EPCs 12 h、24 h、36 h、48 h、72 h OD535高于A组、C组，EPCs穿膜细胞数多于A 组、C组，提示氯沙坦可促进慢性心力衰竭患者外周血 EPCs增殖和迁移。CHEN等[15]研究表明，激活PI3K/ Akt/eNOS信号通路可提高小鼠外周血EPSs增殖、迁移 和新生血管分化能力。本研究结果显示，B组EPCs的 Akt和eNOS蛋白表达量高于A组、C组，提示氯沙坦 PI3K/Akt - mediated eNOS phosphorylation [ J ]. Brain Res Bull, 2012, 89 ( 1/2 )： 65 - 70. DOI： 10. 1016/j. brainresbull.2012. 06. 010.
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可提高慢性心力衰竭患者外周血EPCs的Akt和eNOS蛋 白表达量，其可能通过调节PI3K/Akt/eNOS信号通路而 发挥作用。
综上所述，氯沙坦可促进慢性心力衰竭患者外周血 EPCs的增殖和迁移，可改善内皮细胞功能，有一定的 临床参考价值。但本研究仍处于EPCs研究的初级阶段， 有待进一步深人研究，今后研究方向为EPCs在冠心病、 脑出血、高血压等疾病治疗中的应用效果。
作者贡献：陈菊明进行实验设计与实施、资料收集 整理、撰写论文、成文并对文章负责；左琦、宋艳玲、 麦华德、纪新博、王雅纯、林芸芸进行实验实施、评 估、资料收集；顾申红进行质量控制及审校。
本文无利益冲突。
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(收稿日期：2017 -04 -03;修回日期：2017 -07 -26)
(本文编辑：李洁晨）
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