阿北医药2010年1O月第32卷第19期2陈锋,刘勇,张宗泽,等.开胸术病人不同参数单肺通气的效果.中华 麻醉学杂志,2006,26:795-797. 3 Kasaba T,Suga R,Matsuoka H,et a1.Comparison of epidural anesthesia and general anesthesia for patients withbron ehialasthma.Masui,2000, 49:1115—1120. Hebei Medical Journa1.2010,Vol 2 Oct No.19 5 Cohen E,Nemura R,Umshibara R,et a1.Bronchial cuff pressure change caused by left—sided double・lumen endobronchil taube displacement.Can J Anaesth,2000,47:775-779. 6 Slinger P.New trends in anesthesia for thoracic surgery including thora- COS-copy.Can J Anaesth,1995,42:77・84. 4 Habre W,Scalfaro P,Sims C,et a1.Respiratory mechanics during¥evoI ̄u— 7徐启明主编.临床麻醉学.第2版.北京:人民卫生出版社,2005. 206. rne anestahesia in children with and without asthma.Anesth Aualg, 1999,89:1177—1181. (收稿日期:2010—05—18) ・论著・ 注射用贞芪扶正对免疫功能低下小鼠的 免疫调节作用 刘焕龙陈雪彦 潘振华 苗庆峰张永健 【摘要】 目的研究注射用贞芪扶正对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用。方法 小鼠腹腔注射环 磷酰胺制备免疫功能低下的动物模型,采用碳廓清实验检测小鼠巨噬细胞的吞噬功能,测定吞噬指数和吞 噬活性;绵羊红细胞的定量溶血测定法测定血清溶血素水平;二硝基氟苯诱导迟发型变态反应模型,观察 不同剂量注射用贞芪扶正对小鼠细胞免疫、体液免疫以及单核-巨噬细胞吞噬功能的影响。结果 注射用 贞芪扶正(3.0和6.O g/ )可提高免疫功能低下小鼠的吞噬指数K和吞噬活性 (P<0.05或<0.01);3 个剂量组注射用贞芪扶正对环磷酰胺导致的血清中溶血素水平的降低均有不同程度的升高(P<0.05或 <0.o1)。另外,3个剂量注射用贞芪扶正均可提高免疫功能低下小鼠的耳肿胀度,中高剂量组对环磷酰胺 导致的胸腺和脾脏指数的降低均有恢复作用(P<0.05或<0.01)。结论注射用贞芪扶正能明显改善 环磷酰胺致的免疫功能低下小鼠的免疫功能。 【关键词】 注射用贞芪扶正;环磷酰胺;免疫功能 【中图分类号】 R 289.5 【文献标识码】 A 【文章编号】 1002—7386(2010)一19—2660—03 Effect of Zhenqifuzheng injection on immunological function in immunosuppressive mice L/U Huardong‘, CHEN Xunyan,PAN Zhenhua,et a1. The secorbd Hospital ofHebei Medical University,Shijiazhnang 105000,China 【Abstract】 Objective To investigate the immunomodulation effect of Zhenqifuzheng injection(ZQFZ)on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide(Cy).Methods The immunity—deficiency models of mice were induced by intraperitoneal injection(ip)with Cy at the dose of 50 mg/kg.The phagocytosis of mononuclear macrophage was determined by cleaning carbon particle method,and the levels of seYum erythrocytolysin were detected by quantitative hemolysis of SRBC,and the mouse delayed type hypersensitivity(DTH)models induced by dinitolfruorobenzene(DNFB)were used to observe the effect of ZQFZ on the cellular and humoral immunity. Results The ZQFZ(3.0 and 6.0g/kg)was able to signiifcantly increase the index of phagocytosis(K)and the activity of phagocytosis(O.r).The levels of hemolysin were also increased by three does of ZQFZ at different degrees(尸<0.05 or P<0.01).Meanwhile,the ear oedema was signiifcantly increased by three does of ZQFZ, the thymus and spleen index were also recovered by ZQFZ(3.0 and 6.0g/kg)(P<0.05 or P<0.01). Conclusion ZQFZ is able to signiifcantly improve the immunological function of immunosuppressive mice induced by Cy. 【Key words】 Zhenqifuzheng injection;cycl。ph0sphamide;immunological function 中药黄芪和女贞子均为传统的扶正中药,两者在临床上常 合并使用,作为癌症患者术后放、化疗时的免疫增强剂,有一定 的增效减毒作用…。现代药理研究表明,黄芪有保护缺血缺氧 项目来源:河北省中医药管理局科研计划课题(编号:2009037) 心肌、双向调节血压、增强免疫力、抗病毒、抗癌、抗衰老、保护 作者单位:050000石家庄市,河北医科大学第二医院药剂科(刘焕 肝脏等药理作用 。女贞子有保护肝脏、增强免疫力、促进红 龙);河北医科大学药理教研室(陈雪彦、潘振华、苗庆峰、张永健) 细胞造血、缓解心绞痛和改善心肌缺血、抗衰老、抗诱变和抗癌 通讯作者:张永健,050017河北医科大学药理教研室; E—mail!zhangyj@hebmu.edu.an 等药理作用。目前含有这两味中药的制剂有贞芪胶囊,贞芪冲 阿北医药2010年10月第32卷第19期Hebei Medical Journal,2010,Vol 32 Oct No.19 2661 剂,贞芪口服液等剂型,但放化疗患者由于胃肠道反应严重而 难以口服用药,影响其吸收及药效的发挥;为解决这一难题,提 高疗效,本课题组研制出注射用贞芪扶正,关于注射用贞芪扶 正能否提高机体的免疫功能,提高恶性肿瘤的治疗效果尚未见 报道,为了考察注射用贞芪扶正的药效作用,本实验进行了注 射用贞芪扶正对环磷酰胺所致免疫功能抑制小鼠的免疫调节 作用的观察。 1材料与方法 1.1药物与试剂注射用贞芪扶正,本课题组研制;贞芪扶正 胶囊,甘肃兰药药业集团有限责任公司;环磷酰胺粉针剂,上海 华联制药公司;二硝基氟苯,上海试剂一厂,用前以丙酮麻油 (1:1)溶液配制1%的应用液;补体:在3只豚鼠的新鲜血清中 加入1/10压积绵羊红细胞,于4℃震荡30 rain,置一20℃保存; 绵羊红细胞:无菌条件下自成年绵羊颈外静脉取血,置于有玻 璃珠的三角烧瓶中轻摇10 min去除纤维蛋白,加入2倍量保存 液,置4 ̄C保存。临用前用0.9%氯化钠溶液洗涤3次, 2 000 r/rain离心10 rain得压积红细胞,再按所需浓度稀释。 1.2动物昆明种小鼠,6—8周龄,体重18~22 g,雌雄各半, 由河北医科大学实验动物中心提供,合格证号:602056。 1.3仪器AL204电子天平:梅特勒.托利多仪器(上海)有限 公司;酶标仪fluostar:德国BMG公司。 1.4动物分组与给药昆明种小鼠6O只,随机分成6组,第 组10只。分别为正常对照组、环磷酰胺免疫低下组、环磷酰胺 +注射用贞芪扶正3个剂量组(1.5、3.0和6.0 g/kg)(注射用 贞芪扶正组l、2、3)、环磷酰胺+贞芪扶正胶囊组(3 kg,灌胃 给药)(贞芪扶正胶囊组)。正常对照组、环磷酰胺免疫低下组 腹腔注射0.9%氯化钠溶液,1次/d,连续7 d。给药第3天除 正常对照组外每只小鼠腹腔注射环磷酰胺50 m kg,连续2 d, 制备免疫功能低下的动物模型。 1.5注射用贞芪扶正对免疫低下小鼠非特异性免疫功能的影 响(碳粒廓清法) 60只小鼠于末次给药1 h后,每鼠尾静脉 注射离心后50%的印度墨汁(0.1 mL/lO g),注射后2 min(t1) 和8 min(t2)分别从眼眶后静脉丛取血20 ,加到2 ml 0.1% 碳酸钠溶液中摇匀,722分光光度计650 nm比色,测吸光度值 (OD)。记录小鼠体重,然后脱臼处死小鼠,取出肝脏和脾脏, 称重。按下式计算吞噬指数K及吞噬活性 。 吞噬指数K=(1og㈣一logoD2)/(t2一t1)(上式中OD1、OD2 为不同时间所取血样的光密度,t2一t1为取两血样的时间差)。 吞噬活性o【=K ×体重/(肝重量+脾重量)。 1.6注射用贞芪扶正对免疫低下小鼠特异性体液免疫功能的 影响 6O只小鼠,于给药后第3天6组均腹腔注射20%压 积绵羊红细胞0.2 ml/只致敏。同时除对照组外均制备免疫低 下模型。末次给药后1 h从小鼠眼底静脉丛取血,制备血清,稀 释500倍备用。将稀释好的血清l ml置试管中,依次加入 5%(v/v)的绵羊红细胞0.5 ml,10%补体1 ml,置37℃恒温水 浴中保温30 rain后,移至冰浴中中止反应,1 500 r/min离心 5 rain。取上清液1 ml,加文齐试剂3 ml,摇匀,室温放置 10 min,于波长540 13m处比色读取吸光度值(取5%的绵羊红 细胞0.25 ml,加文齐试剂至4 ml,比色读取吸光度值,即为绵羊 红细胞半数溶血的吸光度值)。按下列公式计算每只鼠血清的 。onc5。= x 500。 1.7注射用贞芪扶正对免疫低下小鼠特异性细胞免疫功能的 影响药后第2天,每鼠均腹部去毛3 em×3 cm大小,将1% 二硝基氟苯50 l均匀涂于去毛皮肤上,次日同剂量再涂一次。 同时除正常对照组外均制备免疫低下模型。末次给药后1 h, 将1%二硝基氟苯l0 l均匀涂于小鼠右耳正背两面进行攻 击。攻击24 h后,脱颈椎处死小鼠,用打孔器在两耳相同部位 打取直径8 mm耳片称重。左右耳片重量之差为耳肿胀度。同 时摘取小鼠胸腺、脾脏,精确称重。并计算每l0克体重的脾指 数和胸腺指数 J。 1.8统计学分析应用SPSS13.0统计软件,计量资料以 ±s 表示,各组之间均数的比较用单因素方差分析,进行q检验或 Dunnet t检验,P<0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1 注射用贞芪扶正对免疫低下小鼠非特异性免疫功能的影 响环磷酰胺免疫低下组小鼠的吞噬指数K和吞噬活性 值 均明显低于正常对照组(P<0.01);注射用贞芪扶正2、3组 (3.0、6.0 g/kg)、贞芪扶正胶囊组均可不同程度地提高免疫低 下小鼠的碳吞噬指数K和吞噬活性0l(P<0.05或<0.O1)。 见表1。 表1 注射用贞芪扶正对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠 非特异性免疫功能的影响 n=10, ± 注:与环磷酰胺免疫低下组比较, P<0.05, P<0.O1;与正常对照组比 较, P<0.01 2.2注射用贞芪扶正对免疫低下小鼠体液免疫功能的影响 与正常对照组比较,环磷酰胺免疫低下组小鼠半数溶血值明显 降低(P<0.01);注射用贞芪扶正1、2、3组(1.5、3.0、 6.0 g/kg)及贞芪扶正胶囊组均可不同程度地提高免疫低下小 鼠的半数溶血值(P<0.05或<0.o1)。见表2。 表2 注射用贞芪扶正对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠 血清溶血素形成的影响 n=10,i± 注:与环磷酰胺免疫低下组比较, P<0.05,#P<0.01;与正常对照组比 较,Ap<O.01 2662 北医药2010年10月第32卷第19期Hebei Medical Journal,201 0,V0l 璺: 2.3注射用贞芪扶正对免疫低下小鼠细胞免疫功能的影响 环磷酰胺免疫低下组小鼠耳肿胀程度明显低于正常对照组(P <0.01);注射用贞芪扶正(1.5、3.0、6.0 g/kg)可使小鼠降低 的耳片肿胀度有不同程度的增加(P<0.05或<0.01),使降 低的迟发型超敏反应恢复至接近正常水平。见表3。 2.4注射用贞芪扶正对免疫低下小鼠免疫器官重量的影响 环磷酰胺免疫低下组小鼠脾脏指数和胸腺指数与正常对照组 比较明显降低(P<0.01);ZQFZ(3.0、6.0 g/kg)可以不同程 度提高免疫低下小鼠的脾脏指数和胸腺指数(P<0.05或< 0.01),而低剂量贞芪扶正和贞芪扶正胶囊对脾脏指数和胸腺 针对病原微生物,体液免疫肩负着抗感染、免疫调理等作 用,并通过产生抗体与对应的抗原特异性结合产生各种生物学 效应。血清中溶血素水平测定是将致敏动物血清中循环抗体 与抗原(snBc)一起体外孵育,在补体参与下,产生溶血反应, 用分光光度计测定溶血程度反应抗体形成水平的实验 。血 清溶血素测定不仅反映抗体形成的数量,也提示合成抗体的能 力,是反映体液免疫功能的重要指标。本实验结果表明,注射用 贞芪扶正可显著提高环磷酰胺致免疫功能低下小鼠血清中溶血素 水平。提示注射用贞芪扶正可提高环磷酰胺致免疫低下小鼠的体 液免疫功能。 指数无明显影响。见表3。 表3注射用贞芪扶正对cy致免疫功能低下小鼠 迟发型变态反应的影响 :10,i± 注:与环磷酰胺免疫低下组比较, P<0.05, <0.Ol;正常对照组比 较. P<O.01 3讨论 机体免疫系统是由非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫共 同构成的防御系统。机体免疫功能低下是导致感染、癌症等多 种疾病的一个重要原因。因此,调节机体免疫力是防治疾病的 重要手段。目前依据中医药理论组成的复方制剂对临床常见 的免疫功低下有独特的疗效。贞芪扶正主要由黄芪、女贞子等 名贵中药组成,具有扶正固本、滋阴补肾、补气生血、活血止血 等功能,注射用贞芪扶正是本课题组研制出的新剂型,关于其 能香提高机体的免疫功能,提高恶性肿瘤的治疗效果尚未见报 道,因此本研究从小鼠免疫器官重量、非特异性免疫、体液免疫 和细胞免疫反应几个方面观察了注射用贞芪扶正对小鼠免疫 功能的调节作用。 单核巨噬细胞系统(网状内皮系统)是机体非特异性免疫 系统的重要组成部分,能迅速清除多种致病物质,是维持机体 内环境稳定的一个重要系统。而单核巨噬细胞的吞噬能力又 是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一_6 。小鼠碳廓清实 验中所测得的吞噬指数K可反映网状内皮系统的吞噬功能,吞 噬活性q则反映单核巨噬细胞的吞噬能力。本实验结果发现, 注射用贞芪扶正可明显提高环磷酰胺诱导免疫功能低下小鼠 的吞噬指数K值和吞噬活性 值。提示注射用贞芪扶正可提 高环磷酰胺致免疫功能低下小鼠的巨噬细胞吞噬功能。 迟发型变态反应是由T细胞介导的细胞免疫应答的一种 类型,也是常见的一种免疫反应,在致敏机体接触过敏原后约 24 h以上才出现,病变仅限于抗原所在的局部组织,其实质是 变应原引起的T细胞介导为主的炎症反应,与机体细胞免疫能 力相一致 J。本研究表明,与正常对照组比较,环磷酰胺诱导 免疫低下小鼠耳肿胀程度明显减轻,注射用贞芪扶正可明显 拮抗环磷酰胺诱导免疫低下小鼠耳肿胀度的减轻。另外,免疫 器官的脏器指数是衡量机体免疫功能的初步指标,研究表明, 注射用贞芪扶正能明显改善环磷酰胺引起免疫低下小鼠的脾 和胸腺萎缩,提高胸腺指数和脾脏指数,提示注射用贞芪扶正 可提高环磷酰胺致免疫低下小鼠的细胞免疫功能。 综上所述,注射用贞芪扶正对环磷酰胺致免疫低下小鼠 的单核巨噬细胞吞噬功能、迟发性超敏反应,血清溶血素生成素 生成均有增强作用。这可能为该药治疗免疫低下、免疫缺陷性 疾病提供理论基础和依据,有关详细作用机制尚待进一步研究 阐明。 参考文献 l 任润和.扶正女贞素片和贞芪扶正颗粒对小鼠免疫功能的影响.中 国药物与临床,2007,7:291-293. 2 尚爱莲.贞芪扶正胶囊配合放疗治疗癌症的临床分析.中国现代医 学杂志,2004,14:137. 3葛金芳,李俊胡,成穆,等.枇杷叶三萜酸的免疫调节作用研究.中国 药理学通报,2006,22:1194-1198. 4葛朝亮,刘颖.何首乌多糖对免疫功能低下小鼠的免疫保护作用.中 国新药杂志,2007,16:2040 ̄042. 5方笋,王萌,赵晓娟,等.芍芪多苷对迟发型变态反应小鼠细胞免疫 功能的影响.中国药理学通报,2008,24:444-448. 6 Kim JH,Park JS.Potentiation of the immunotoxicity of ethanol by acet・ aminophen in mice.Int Immunopharmacol,2002,2:15-24. 7 Banerjee BD,Pasha ST,Hussain QZ,et 1a.A comparative evaluation of immunotoxicity of malathion after subchronic exposure in experimental animals.Indian J Exp Biol,1998,36:273-282. 8方笋,王萌,赵晓娟,等.芍芪多苷对迟发型变态反应小鼠细胞免疫 功能的影响.中国药理学通报,2008,24:44_4—448. (收稿日期:2010—05—27)