山东医药２０１３年第５３卷第ｌ０期 ・论著・ 人ＳＵＭＯ病毒载体构建及稳转神经母 细胞瘤ＳＨＳＹ５Ｙ细胞系的建立 常晶，陆菡，薛庆生，于布为 （上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海２０００２５） 摘要：目的构建表达人小泛素化相关修饰蛋白（ＳＵＭＯ）基因的逆转录病毒载体，并观察其稳定感染神经母细 胞瘤ＳＨＳＹ５Ｙ细胞后ＳＵＭＯ蛋白的表达情况。方法 用ＥｃｏＲ Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ双酶切ｐｃＤＮＡ ３．０一ＨＡ—ＳＵＭＯ１、ｐｃＤＮＡ ３．０．ＨＡ—ＳＵＭＯ２、ｐｃＤＮＡ ３．０一ＨＡ－ＳＵＭＯ３质粒，得到３ Ｘ Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯｓ基因的编码序列，定向插入到ｐＢａｂｅ—ｐｕｒｏ载体 中，经扩增、筛选阳性克隆、酶切和测序验证后，转染２９３Ｔ细胞进行病毒包装、扩增、纯化获取逆转录病毒颗粒。将 逆转录病毒颗粒感染ＳＨＳＹ５Ｙ细胞，经嘌呤霉素筛选后抗性克隆集落长出。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测稳定转染的ｐＢａｂｅ－３ ×Ｆｌａｇ．ＳＵＭＯｓ．ＳＨＳＹ５Ｙ单克隆细胞ＳＵＭＯ１—３的表达。结果ｐＢａｂｅ一３ Ｘ Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯｓ．ｐｕｒｏ质粒构建正确。稳定转 染的ＳＨＳＹ５Ｙ细胞系３ Ｘ Ｆｌａｇ．ＳＵＭＯｓ表达明显增强。结论成功构建了稳定表达ＳＵＭＯ的ｐＢａｂｅ－３ Ｘ Ｆｌｇａ—ＳＵＭＯｓ－ ＳＨＳＹ５Ｙ细胞系。 关键词：小泛素化相关修饰蛋白；逆转录病毒；神经母细胞瘤细胞 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－２６６Ｘ．２０１３．１０．００１ 中图分类号：Ｒ３２９．２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１３）１０－０００１－０３ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＳＵＭＯ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ Ｏｆ ｉｔｓ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＳＨＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌｌｉｎｅ ＣＨＡＮＧ】ｔｎｇ，ＬＵ Ｈａｎ，ＸＵＥ Ｑｉｎｇ－ｓｈｅｎｇ，ＹＵ Ｂｕ—ｗｅｉ （Ｒｕｏ＇ｉｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００２５，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＳＵＭＯ ｇｅｎｅ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ａ ＳＨＳＹＳＹ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｓｔａｂｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＳＵＭＯ ａｎｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＳＵＭＯ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＳＨＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｐｃＤＮＡ３．Ｏ－ＨＡ－ＳＵＭＯ１，ｐｃＤＮＡ ３．Ｏ－ＨＡ．ＳＵＭＯ２．ｐｃＤＮＡ３．０－ＨＡ—ＳＵＭＯ３ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＥｃｏＲ Ｉ ａｎｄ Ｘｈｏ Ｉ ｔｏ ｇｅｔ ｔｈｅ ３×Ｆｌａｇ－ＳＵＭＯｓ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｔｈｅｎ ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＢａｂｅ—ｐｕｒｏ ｖｅｃｔｏｒ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅ ｗａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｖｅｒｉｉｆｅｄ ａｎｄ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ． Ｃｅｌｌ ２９３Ｔ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐＢａｂｅ－ｐｕｒｏ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ＳＨＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌ ｗａｓ ｔｈｅｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ３×Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯｓ ｗａｓ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｌｅａｓｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐＢａｂｅ－３×Ｆｌａｇ－ＳＵＭＯｓ－ｐｕｒｏ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ３×Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯｓ ｉｎ ｓｔａｂｌｙ ｉｆｎｅｃｔｅｄ ＳＨＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｂｙ Ｆｌａｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＳＨＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｓｔａｂｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ３ ×Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯｓ ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｍａｌｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ—ｌｉｋｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ；ｒｅｔｒｏｖｉｕｒｓ；ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ 小泛素化相关修饰蛋白（ＳＵＭＯ）是一种新的类 巴结、脾脏表达外 ，ＳＵＭＯ１～３均在神经系统及 泛素家族成员，ＳＵＭＯ化介导的蛋白翻译后修饰是 其他系统内广泛表达。ＳＨＳＹ５Ｙ细胞系属人神经母 调控神经元功能的重要机制 。脊椎动物ＳＵＭＯ 细胞瘤ｓＫ—Ｎ—ＳＨ细胞系的一个亚类，不仅形态类似 家族有ＳＵＭＯ１—４四个成员，除ＳＵＭＯ４仅在肾、淋 神经元，在功能方面也表现出活体神经元的特 基金项目：国家自然科学基金资助项目（８１１０２５１３，８１０７２７０３）。 作者简介：常晶（１９８６一），女，研究方向为全麻机制、麻醉与学习记忆的关系。Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｈａｎｇｊｉｎｇ１０１７５２４８＠１２６．ｃｏｌｒｌ 通讯作者：于布为（１９５５一），男，博士，教授，主任医师，研究方向为全麻机制、麻醉药物与记忆的关系、慢性疼痛的基因治疗等。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｂｕｗｅｉ ＠ｙａｈｏｏ．ｔｏｍ．ａｎ 点 ］。２０１２年９—１１月，我们将具有嘌呤霉素抗性 的逆转录病毒载体与疱疹性口腔炎病毒糖蛋白Ｇ 基因（ｐＶＳＶＧ）及ＨＩＶ的ｇａｇ－ｐｏｌ基因共转染２９３Ｔ 细胞，形成高滴度的逆转录病毒，感染ＳＨＳＹ５Ｙ细胞 以构建表达ＳＵＭＯ的稳转细胞系，旨在为进一步研 究ＳＵＭＯ在中枢神经系统中的作用奠定基础。 １材料与方法 １．１ 材料与试剂 人神经母细胞瘤ＳＨＳＹ５Ｙ细胞 （低分化）购于美国典型培养物保藏中心（ＡＴＣＣ）。 ２９３Ｔ细胞购于中国科学院细胞库。ｐｃＤＮＡ３．０－ＨＡ－ ＳＵＭＯ１、ｐｃＤＮＡ３．０－ＨＡ—ＳＵＭＯ２、ｐｃＤＮＡ３．０－ＨＡ－ＳＵ— Ｍ０３质粒及ｐＢａｂｅ－３×Ｆｌａｇ—ｐｍｏ、ｐＶＳＶＧ和ｇａｇ－ｐｏｌ 质粒均由上海交通大学医学院细胞信号转导实验室 程金科教授惠赠。 ＤＭＥＭ培养液购自Ｇｉｂｃｏ公司， 感受态Ｔｏｐ１０与ＤＮＡ凝胶纯化试剂盒购白天根科 技，限制性内切酶及ＤＮＡ连接试剂盒均购自Ｐｒｏ— ｍｅｇａ公司，反转录试剂盒购自Ｔａｋａｒａ公司，转染试 剂ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＭＴ２０００购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，Ｆｌａｇ Ｍ２抗体购自Ｓｉｇｍａ公司。引物合成服务由上海生 工生物工程有限公司提供，质粒测序由北京六和华 大基因科技公司完成。 １．２实验方法 Ｉ．２．１ ｐＢａｂｅ一３×Ｆｌａｇ－ＳＵＭＯｓ－ｐｕｒｏ的构建ｐＢａｂｅ－ ３×Ｆｌａｇ—ｐｕｒｏ在ｐＢａｂｅ—ｐｕｒｏ质粒基础上改造而来。 用ＥｃｏＲ Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ双酶切ｐｃＤＮＡ３．０一ＨＡ—ＳＵＭＯ１、 ｐｃＤＮＡ３．０－ＨＡ－ＳＵＭＯ２、ｐｃＤＮＡ３．０－ＨＡ—ＳＵＭ０３质 粒，用ＥｃｏＲ Ｉ和Ｓａｌ Ｉ双酶切ｐＢａｂｅ—ｐｕｒｏ载体，酶切 产物经琼脂糖电泳后，分别回收并纯化相应ＤＮＡ片 段。用ＤＮＡ连接酶将二者酶切产物连接。ｌ６℃过 夜。连接产物转化感受态细菌Ｔｏｐｌ０，３７℃过夜。 酚一氯仿初步筛选后选阳性克隆进行扩增，碱裂解 法提取ｐＢａｂｅ．３×Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯｓ—ｐｕｒｏ质粒。 １．２．２ ｐＢａｂｅ－３×Ｆｌａｇ－ＳＵＭＯｓ－ｐｕｒｏ的鉴定 用 ＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ和Ｓａｌ １分别单酶切重组表达载体， 经Ｉ％琼脂糖凝胶电泳初步检测片段长度后测序证 实。ＤＮＡ测序鉴定：ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３通用 上游引物为：５ 一ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴ— ＧＴｒ－３ ；ＳＵＭＯ１下游引物为：５ －ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡ－ ＡＡＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＡＣＣ一３ ；ＳＵＭＯ２下游引物为：５ 一 ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＡＧＡＣＡＣＣＴＣＣＣＧＴ一３ ： ＳＵＭＯ３ 下游引物为：５ 一ＣＣＧｃＴＣＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣ— ＣＣＴＧＣ－３ 。 １．２．３病毒包装取处于对数生长期的２９３Ｔ细胞 传代，待细胞达到７５％密度时转染。将测序正确的 ｐＢａｂｅ一３×Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯｓ－ｐｒｕｏ的质粒、ｐＶＳＶＧ和ｇａｇ－ ２ 山东医药２０１３年第５３卷第１０期 ｐｏｌ共同转染２９３Ｔ细胞，同时设立空载体对照组 （ＭＯＣＫ组）。目的质粒、ｐＶＳＶＧ和ｇａｇ—ｐｏｌ的转染 比例为１：１：１。４８ ｈ后收集逆转录病毒上清，经 ０．４５ ｍ滤器过滤、分装，一８０℃冰箱保存。 １．２．４ ｐＢａｂｅ一３×Ｆｌａｇ．ＳＵＭＯｓ—ＳＨＳＹ５Ｙ稳转细胞系 的建立 １．２．４．１ ＳＨＳＹ５Ｙ细胞嘌呤霉素最小致死浓度的 确定及稳定表达抗性细胞株的筛选取２４孔板接 种适量ＳＨＳＹ５Ｙ细胞，待细胞达到７５％密度时，加 入不同浓度的嘌呤霉素（０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ Ｉ￣ｇ／ｍＬ），每一浓度设３个孔，２ ｄ后根据细胞死亡情 况确定嘌呤霉素对ＳＨＳＹ５Ｙ细胞的最小致死浓度。 待６孑Ｌ板中ＳＨＳＹ５Ｙ细胞融合度达７５％时，分别加 入１．５ ｍＬ包装了３×Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯ１、３×Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯ２ 和３×Ｆｌａｇ．ＳＵＭ０３质粒的病毒上清于３７ ｏＣ、５％ ＣＯ 培养箱培养２４ ｈ后，更换为含６ ｐＬｇ／ｍＬ嘌呤霉 素的筛选培养基培养，２—３ ｄ换液１次，并重新加入 嘌呤霉素。待未加入病毒感染的培养基内ＳＨＳＹ５Ｙ 细胞（Ｍｏｃｋ组）死亡后，有抗性克隆集落长出时继 续加入嘌呤霉素培养。 １．２．４．２ ｐＢａｂｅ－３×Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯｓ—ｐｕｒｏ在ＳＨＳＹ５Ｙ 单克隆细胞中的表达测定 采用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法将 筛选获得的ｐＢａｂｅ一３×Ｆｌａｇ－ＳＵＭＯｓ－ｐｕｒｏ细胞单克隆 分别用胰酶消化收集细胞，ＰＢＳ洗涤后加入２×ＳＤＳ 超声裂解，４℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，取上清分 装。取适量蛋白稀释后进行蛋白定量。将各样品蛋 白稀释至相同浓度，１００ ｏＣ水浴１０ ｍｉｎ，等量加入 １０％～１２％ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，并电 转入ＰＶＤＦ膜中，用５％脱脂牛奶室温封闭１ ｈ，加 入稀释的抗Ｆｌａｇ抗体，室温孵育１ ｈ，ＴＢＳＴ洗３次 （５～１０ ｍｉｎ／次）。二抗（辣根过氧化物酶连接的羊 抗鼠抗体）孵育１ ｈ，ＴＢＳＴ洗３次（５～１０ ｍｉｎ／次）。 采用ＦＵＪＩＦＩＬＭ ＬＡＳ－４０００光成像系统进行图片显 像。 ２结果 ２．１ ｐＢａｂｅ－３×Ｆｌａｇ－ＳＵＭＯｓ－ｐｕｒｏ的鉴定将构建 的ｐＢａｂｅ一３×Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯｓ—ｐｕｒｏ质粒经ＤＮＡ测序，结 果显示ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３及ＭＯＣＫ组的模板 均成功构建于ｐＢａｂｅ一３×Ｆｌａｇ—ｐｕｒｏ载体上，序列完 全正确，与目的序列相同。 ２．２ ｐＢａｂｅ一３×Ｆｌａｇ－ＳＵＭＯｓ－ｐｕｒｏ在ＳＨＳＹ５Ｙ细胞 中的表达Ｗｅｓｔｅｎｒ ｂｌｏｔ结果显示抗Ｆｌａｇ的抗体能 检测到通过病毒转染的ｐＢａｂｅ．３×Ｆｌａｇ．ＳＵＭＯｓ．ｐｕｒｏ 在ＳＨＳＹ５Ｙ细胞中的表达，由图１可以看出，病毒转 染ｐＢａｂｅ－３×Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯｓ・ｐｕｒｏ的ＳＨＳＹ５Ｙ细胞中 山东医药２０１３年第５３卷第１Ｏ期 ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３的含量明显多于ＭＯＣＫ 病毒感染稳转ｐＢａｂｅ－３×Ｆｌａｇ－ＳＵＭＯｓ—ｐｕｒｏ质粒，使 ＳＵＭＯ１—３在ＳＨＳＹ５Ｙ细胞系中有一定的高表达， 组。同时，只有转染ｐＢａｂｅ－３×Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯｓ—ｐｕｒｏ的 ＳＨＳＹ５Ｙ细胞能被Ｆｌａｇ抗体在相应的位置检测到条 带。见图１。 １ ２ １ ３ １ ４ 对ＳＵＭＯ修饰的增减变化起了放大的作用，并通过 Ｆｌａｇ对ＳＵＭＯ进行标记，选用抗Ｆｌａｇ抗体进行放 大，增加了ＳＵＭＯ变化的可检测性，很好地解决了 商品化的ＳＵＭＯ抗体因检测的特异性和灵敏性偏 低对结合态和游离态的ＳＵＭＯ蛋白表达显示不清 晰的问题。 结合态ＳＵＭＯｓ 目前大多数转染实验使用的是脂质体转染，转 游离态ＳＵＭＯｓ Ｆｌａｇ抗体 图１ ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３在ＳＨＳＹ５Ｙ 细胞中的表达（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法） 注：１为Ｍｏｃｋ组；２为ｐＢａｂｅ－３×Ｆｌａｇ ＳＵＭＯ１一ｐｕｒｏ；３为ｐＢａｂｅ－３ ×Ｆｌａｇ ＳＵＭＯ２・ｐｕｍ；４为ｐＢａｂｅ－３×Ｆｌａｇ ＳＵＭＯ４一ｐｕｒｏ ３讨论 ＳＵＭＯ化介导的蛋白翻译后修饰被认为是调控 神经元功能的重要机制。ＳＵＭＯ能可逆地与靶蛋白 赖氨酸残基进行多肽共价修饰，从而调节底物功 能…。ＳＵＭＯ化修饰广泛参与了基因转录的调控、 细胞周期的调控、蛋白翻译后修饰等过程，在信号转 导、核质运输、泛素化的拮抗等方面均发挥重要作 用。ＳＵＭＯ化修饰的理论基础为蛋白质学说，其发 生与去除都能够改变蛋白质的功能。除了已经发现 的膜蛋白外，ＳＵＭＯ化修饰蛋白大多属于细胞信号 转导通路，在转录因子的转录开放过程中发挥着重 要作用，最终能够影响一系列基因的转录水平 Ｊ。 然而，ＳＵＭＯ体系的许多特点增加了研究的难度，比 如修饰水平普遍较低，在生理状态下存在大量去 ＳＵＭＯ化酶系，ＳＵＭＯ相关蛋白复合体系形式多样， 发挥作用的酶和底物种类繁多等 。因ＳＵＭＯ修 饰水平低，对研究的灵敏度和准确度提出了更高的 要求。因此排除诸多干扰因素，对ＳＵＭＯ体系进行 确切的分析，就要求建立针对ＳＵＭＯ修饰的特定研 究工具，人ＳＵＭＯ稳转的细胞系即是诸多研究工具 中的一种。由于无论在人体内或体外组织细胞中 ＳＵＭＯ化的修饰水平均较低，不容易被观察和检测 到，因此，通过构建ＳＵＭＯ表达的稳转细胞系来放 大ＳＵＭＯ化修饰的变化趋势，使其易于观察和检测 就成为研究ＳＵＭＯ这一蛋白翻译后修饰的首要环 节。鉴于常规的脂质体等方法转染ＳＨＳＹ５Ｙ细胞效 率较低，本研究选用逆转录病毒作为转染工具，通过 入细胞的基因表达会随着细胞的传代逐渐降低。而 经逆转录病毒系统包装后的外源基因可以稳定高效 地整合入宿主基因组，稳定介导基因表达；包装成熟 的病毒颗粒以出芽生殖的方式进入到细胞培养液上 清液中，易于与宿主细胞分离，制备方便 Ｊ。本研 究通过酶切与亚克隆技术成功构建了重组逆转录病 毒质粒ｐＢａｂｅ－３×Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯｓ—ｐｒｕｏ，通过转染及筛 选产生高滴度逆转录病毒颗粒，并感染ＳＨＳＹ５Ｙ细 胞，得到了稳定表达的ｐＢａｂｅ一３×Ｆｌａｇ—ＳＵＭＯｓ— ＳＨＳＹ５Ｙ细胞系，为进一步研究ＳＵＭＯ在神经系统 蛋白翻译后修饰及信号转导中的作用奠定了基础。 参考文献： ［１］Ｇｅｉｓｓ—Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ Ｒ，Ｍｅｌｃｈｉｏｒ Ｆ．Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ：ａ ｄｅｃ— ａｄｅ ｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００７，８（１２）：９４７－９５６． ［２］Ｊｏｈｎｓｏｎ ＥＳ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＳＵＭＯ［Ｊ］．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏ－ ｃｈｅｍ，２００４，７３（１６）：３５５－３８２． ［３］￣＇ｕｍｏｖａ Ｐ，Ｗｃｉｓｈａｕｐｔ ＪＨ．Ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｍｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａ－ ｓｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，２０１２，６９（２１）：３３５－３４０． ［４］Ｓｏｎｇ ＧＧ，Ｃｈｏｉ ＳＪ，Ｊｉ ＪＤ，ｅｔ ａ１．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ＳＵＭＯ４ Ｍ５５Ｖ（Ａ１６３Ｇ）ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅ— ｔｅｓ：ａ ｍｅｔａ—ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２，７３（１０）：１０５５— １０５９． ［５］Ｋａｍｏｕｎ Ｍ，Ｂｅｎ—Ｄｈｉｆｌａｌａｈ Ｉ，Ｋａｒｒａｙ Ｅ，ｅｔ １ａ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｏｄｉｉｆｅｒ ４（ＳＵＭＯ４）ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ａ Ｔｕｎｉｓｉａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂｅｈｃｅｔ Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２０１０， ２８ ｆ４ Ｓｕｐｐｌ ６０）：４５－４９． ［６］Ｍｏｒａｌｅｓ—Ｈｅｍａｎｄｅｚ Ａ，Ｓａｎｃｈｅｚ—Ｍａｒｔｉｎ ＦＪ，Ｈｏｒｔｉｇｏｎ．Ｖｉｎａｇｒｅ ＭＰ，ｅｔ ａ１．２，３，７，８－ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ—Ｐ—ｄｉｏｘｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｄｉｓ－ ｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＳＨＳＹ５Ｙ［Ｊ］．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２０１２，１７（１１）：１１７０－１１８１． ［７］Ｈａｙ ＲＴ．ＳＵＭＯ：ａ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２００５，１８ （１）：１－１２． ［８］Ｇａｍａ—Ｓｏｓａ ＭＡ，Ｄｅ Ｇａｓｐｅｒｉ Ｒ，Ｅｌｄｅｒ ＧＡ．Ａｎｉｍａｌ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｅｔ，２０１０，２１４（２－３）：９１—１０９． ［９］Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｔ，Ｋｏｓｈｉｎｏ Ｙ，Ｓｈｉｂａｔａ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ：ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌｓ ｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍ－ ｉｃｓ［Ｊ］．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ，２００３，３１（１１）：１００７－１０１４． （收稿日期：２０１２—１２－０３） ３