一、脲酶测定(比色法)
1.方法原理
脲酶广泛存在于土壤中，它能酶促尿素分解生成氨、二氧化碳和水。测定脲酶的方法很多，包括比色法、扩散法、电极法等，其中比色法最为常用。现介绍苯酚一次氯酸钠比色法，该方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚次氯酸钠作用(在碱性溶液中及在亚硝基铁氰化钠催化剂作用下)生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。
2.试剂配制
（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
3.操作步骤
取5g风干土置于50mL三角瓶中，加1mL甲苯。15min后加10mL10％尿素溶液和20mLpH=6.7柠檬酸盐缓冲液。摇匀，37℃恒温箱中培养24h。过滤，取1mL滤液注入50mL容量瓶中，然后按配制标准曲线显色方法进行比色测定（为了消除土壤中原有的尿素而引起的误差，每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。）。
标准曲线配制：分别取0、l、3、5、7、9、11、13mL氮工作液，移于50mL容量瓶中，然后加蒸馏水至20mL。再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液。随加随摇匀。20min后显色，定容。lh内在分光光度计上于波长578nm处比色。根据吸光值与氮溶液浓度绘制标准曲线。
4.结果计算
以24h后lg土壤中NH3一N的质量(mg)表示脲酶活性(Ure)：
Ure=a·V·n／m
式中：a为由标准曲线求得的NH3一N浓度(mg／mL)；
V为显色液体积(50mL)；
n为分取倍数；
m为烘干土重(g)。
二. 过氧化氢酶测定(容量法)（比较好测）
1. 试剂配制
（1）0.3％过氧化氢溶液：按1:100将30%H2O2用水稀释
（2）3N 硫酸：168ml浓硫酸定容于2L容量瓶
（3）0.1N 高锰酸钾（1/5KMnO4）溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161g，溶于1升无CO2蒸馏水中，贮于综色瓶中，备用。
（4）草酸钠（标定1/5KMnO4）：105~110℃烘至恒重，称取0.2g（准至0.0001g），溶于100mL（8+92）硫酸溶液中。
2. 操作步骤
取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％H2O2溶液。（同时设置无土对照）。振荡20min后，加入5mL3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点。
3. 结果计算
M=(V1-V2)*T/g
M-活性值； V1-样品消耗的0.1N高锰酸钾溶液的ml数
V2-对照消耗的0.1N高锰酸钾溶液的ml数； T-0.1N高锰酸钾滴定矫正值； g-样品重
用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。 （A-B）×T即为过氧化氢酶活性。以20min后1g土壤的0.1N高锰酸钾的毫升数表示。式中T为高锰酸钾滴定度的校正值。（就是最后换算成每克，所以还要测土壤含水量）
高锰酸钾溶液标定
用配制好的高锰酸钾溶液[c（KMnO4）=0.1mol/l]滴定基准草酸钠溶液，近终点时加热至65℃，继续滴定至溶液呈粉红色保持30s，同时作空白试验。
高锰酸钾溶液标准浓度计算
c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.06700
式中 c（1/5KMnO4）=—高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L； m——草酸钠之质量，g； V1——高锰酸钾溶液之用量，mL； V2——空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL；
0.06700——与1.00mL高锰酸钾溶液c（1/5KMnO4）=1.000mol/l相当的以克表示的草酸钠的质量。
三、蔗糖酶测定（比色法）：
1.方法原理
蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。因此，蔗糖酶活性可以根据水解生成物与某些物质(如3，5一二硝基水杨酸或磷酸铜)生成的有色化合物含量来确定。现介绍3，5一二硝基水杨酸比色法，该方法以蔗糖为基质，根据葡萄糖与3，5一二硝基水杨酸反应生成的黄色产物，来确定土壤蔗糖酶活性。
2.试剂配制
（1）3，5－二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20mL2N氢氧化钠和50mL水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过7天）。（必须严格按顺序配）
（2）pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（23.876g磷酸氢二钠.12H2O溶于1L水中）0.5mL加1/15M磷酸二氢钾（9.078g磷酸二氢钾溶于1L水中）9.5mL即成。
（3）8％蔗糖溶液：80g蔗糖溶于1000mL水中
（4）甲苯
（5）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖预先在80℃烘至恒重。然后取500mg溶于100mL蒸馏水中，即成标准葡萄糖溶液(5mg还原糖/mL）。再将次液稀释10倍制成葡萄糖工作液(0.5mg/mL）。
3.操作步骤
称取2g风干土，置于50mL三角瓶中，注入15mL8％蔗糖溶液，5mLpH值为5.5磷酸缓冲液和5滴（0.25ml）甲苯。摇匀后，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。吸取滤液lmL注入50mL容量瓶中，加3mL3，5一二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3一氨基一5一硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。）
标准曲线配制：取0、l、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光值为纵坐标。葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。
3、结果计算
以24h后1g土壤中葡萄糖的质量（mg）表示蔗糖酶活性（Suc）：
Suc＝a·V·n/m
式中：a为由标准曲线求得的葡萄糖浓度（mg/mL）；
V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；
m为烘干土重（g）。
4.磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法)：
1.方法原理
测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。后一种称为无机磷含量法。研究证明，磷酸酶有3种最适pH值：4～5、6～7和8～l0。因此，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有乙酸盐缓冲液(pH值=5.0～5.4)、柠檬酸盐缓冲液(pH值=7.0)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值=7.0～8.5)和硼酸缓冲液(pH值=9～10)。磷酸酶测定时常用的基质有磷酸苯二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β-萘酚磷酸钠，ρ-硝基苯磷酸钠等。现介绍磷酸苯二钠比色法。
2.试剂配制
（1）甲苯
（2）磷酸苯二钠：称取6.75g磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2.2H2O），用缓冲液稀释至1L（1毫升含25mg酚）
（3）pＨ9.0硼酸盐缓冲液
A：0.05M硼砂溶液：19.07g硼砂（Na2B4O710H2O）溶于1000mL蒸馏水中
B：0.2M硼酸溶液：12.37g硼酸（H3BO3）溶于1000mL蒸馏水中
硼酸盐缓冲液（pH9.0）：80mLA+20mLB混匀即得
（4）缓冲溶液配制：
a．酸性磷酸酶:醋酸盐缓冲液(pH=5.0)
A：0.2M醋酸钠溶液：16.4g 无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于1000mL蒸馏水中，或是27.2g三水醋酸钠（C2H3O2Na.3H2O）溶于1000mL水中。
B：0.2M醋酸溶液：11.55mL醋酸定容于1000mL
7mLA＋3mLB混合即得
b．碱性磷酸酶：硼酸盐缓冲液（pH10.0）
A：硼砂液：19.072g硼砂溶于1000mL蒸馏水中
B：氢氧化钠溶液：4g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中
50mLA＋43mLB加水稀释至200mL，混匀即得
c．中性磷酸酶：柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）
A：0.1M柠檬酸溶液：21.01g柠檬酸. H2O（或是19.21gC6H8O7）溶于1000mL蒸馏水中
B：0.2M磷酸氢二钠：35.61g磷酸氢二钠.2 H2O（53.63g磷酸氢二钠.7 H2O或是71.7g磷酸氢二钠.12 H2O）溶于1000mL蒸馏水中
3.63mLA+16.37mLB混匀即得
（5）2.5％铁氰化钾：12.5g铁氰化钾溶于500ml水
（6）0.5％的4－氨基安替吡啉溶液：2.5g4－氨基安替吡啉溶液溶于500ml水
（7）酚原液：2克酚溶液蒸馏水定容致1升（2mg/mL），溶液在暗色中稳定。
（8）酚工作液：取2.5mL原液稀释至100mL（0.05mg酚/mL）
3.操作步骤：
称取5ｇ土于50mL三角瓶中，加1mL甲苯，轻摇15min。再加入20mL磷酸苯二钠(酸性磷酸酶用pＨ5.0大醋酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液)，仔细摇匀后放入恒温箱,在37℃下培养24ｈ。
用致密滤纸过滤。取1mL滤液于100mL容量瓶中，加5mL pＨ9.0硼酸盐缓冲液，再加入3mL 2.5％的铁氰化钾和3mL 0.5％的4－氨基安替吡啉溶液，摇动，仔细混匀，这时溶液呈粉红色，然后加水定容。待颜色稳定时（20-30min），在波长570nm处测定各样品的消光值。土壤的磷酸酶活性根据标准曲线求出酚的含量（为了消除土壤引起的误差，每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。）。
磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示（若用P的毫克数表示，结果需乘0.32；若用P2O5的毫克数表示，需乘2.29）。
标准曲线配制：：分别向100mL容量瓶中注入0，1，3， 5，7，9，11mL工作液并
显色定容（分别相当于0.05，0.15，0.25，0.35，0.45，0.55mg酚），待颜色稳定后，比色绘制标准曲线。
4.结果计算
以24h后1g土壤中释出的酚的质量(mg)表示磷酸酶活性(Pho)：
Pho=a·V·n／m
式中：a为由标准曲线求得的酚浓度(mg／mL)；V为显色液体积(50mL)；n为分取倍数；m为烘干土重(g)。
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