江西中医药２０１１年６月第６期总４２卷第３４２期 通心脉方对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用 ★ 郑晓丹 严世芸 秦仲君 （１．上海中医药大学附属曙光医院心内科上海２０００２１；２．上海中医药 大学基础医学院上海２０１２０３；３．江西九江学院基础医学院病理生理教研室九江３３２０００） 摘要：目的：观察通心脉方（ＴＸＭ）对大鼠离体心脏缺血再灌损伤的影响。方法：４８只ｗｉｓｔａｒ大鼠随机分为６组：正常灌流组， 缺血再灌注组（ＩＲ），ＴＸＭ大、中、小剂量组，卡维地洛组。前两组予以生理盐水１０ ｍＬ／（ｋｇ・ｄ） 灌胃，ＴＸＭ大、中、小剂量组分 别予以含生药１１．４、５．７、２．９ ｇ（ｋｇ・ｄ）Ｉ１醇提物灌胃，卡维地洛组予以卡维地洛２ ｍｇ（ｋｇ・ｄ） 灌胃，共１５天。采用Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆ 离体心脏灌流方法，停灌５０分钟后复灌６０分钟模拟缺血再灌注模型。观察左室舒张末压（ＬＶＥＤＰ）、左室发展压（ＬＶＤＰ）、左 室压力上升和下降最大变化速率（－４－ｄｐ／ｄｔ ｍａｘ）、冠脉灌注压（ＣＰＰ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）、丙二醛 （ＭＤＡ）及乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）含量的变化。采用光镜观察，标本用甲醛固定，石蜡包埋，苏木精一伊红染色，２００倍光镜观察心 肌形态结构。结果：与ＩＲ组比较，ＴＸＭ大、中剂量组及卡维地洛组心功能明显改善，ＳＯＤ、ＣＡＴ酶活性显著升高而ＭＤＡ及 ＬＤＨ含量显著降低，缺血再灌注光镜下心肌损伤明显改善。结论：ＴＸＭ对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。其机制可 能与清除自由基，抑制脂质过氧化有关。 照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各１０ ， 计算马钱苷的含量。结果样品中马钱苷平均含量为 分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果：在此条件 ０．４３０ ０ ｍｇ／ｇ，ＲＳＤ为１．４３％（ｎ＝６）。 下对照品、供试品在约１０分钟相同时间有一色谱 加样回收率试验：取本品适量，研细，取约１ ｇ， 峰；阴性对照对样品溶液色谱在此保留时间无吸收 共６份，精密称定，置具塞三角瓶中，在６份样品中 峰，表明阴性对照品溶液对测定无干扰，选择性较 分别精密加入马钱苷对照品（１７．７２ ｇ／ｍＬ）２５ ｍＬ， 好。 按确定方法制成供试品溶液，吸取ｌ０ 注入液相 线性关系考察：精密称取马钱苷对照品９．９３ 色谱仪中进行含量测定，计算回收率。结果平均回 ｍｇ，置１０ ｍＬ量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度， 收率９９．６２％，ＲＳＤ为１．２７％。 摇匀，制成每１ ｍＬ含马钱苷９９３ Ｉｘｇ溶液。取此对 样品测定：取６批样品，依法配制供试品溶液。 照品加甲醇稀释成以下浓度：９．９３、１９．８６、３９．７２、 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各１０ ，注 ９９．３、１９８．６ Ｉｘｇ／ｍＬ，分别吸取１０ Ｌ，注入液相色谱 入液相色谱仪，含量。结果见表２。 仪中，按确定色谱条件测定，将样品浓度与峰面积进 表２样品含量测定结果 行回归处理，回归方程为：Ｙ＝０．８７８ ７５９＋ ８．１９７ ０３４ ３１２Ｘ，ｒ＝０．９９９ ９９（／２＝６），马钱苷对照品 在９．９３—９９３ Ｉｘｇ／ｍＬ范围内浓度与峰面积呈良好 的线性关系。 精密度试验：精密吸取供试品溶液１０ ，按上 述色谱条件，重复进样６次，测定供试品溶液中马钱 苷峰面积值。结果供试品峰面积的ＲＳＤ为１．７３％ ３结论 （ ＝６），表明仪器精密度良好。 方法学考察结果表明用高效液相色谱法测定补 稳定性试验：取同一批供试品精密吸１０ Ｌ，按 肾强精颗粒中马钱苷含量，平均回收率达９９．６２％， 上述色谱条件，分别于０、０．５、１、２、４、８、１２小时测定 ＲＳＤ为１．２７％，本方法快速、简便、准确，重现性及 供试品溶液中马钱苷峰面积值。结果峰面积变化不 回收率均较好，可作为补肾强精颗粒的质量控制指 大，ＲＳＤ为１．８１％（ ：７），表明供试品溶液稳定性 示。 良好。 参考文献 ［１］国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［ｓ］．北京：化学 重现性试验：取同一批样品适量，研细，各约２ 工业出版社，２００５：２０． ｇ，共６份，精密称定，照含量测定项下方法进行测定 （收稿日期：２０１１－０３ ２８责任编辑：曾文雪） ・６３・ ＪＩＡＮＧＸＩ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＴＲＡＤＩＴＩＯＮＡＬ ＣＨＩＮＥＳＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ 关键词：通心脉方；心肌缺血；再灌注损伤 中图分类号：Ｒ ２８９．５ 文献标识码：Ｂ ＮａＨ２ＣＯ３ ２５，ＫＨ２ＰＯ４ １．２，ＭｇＳＯ４ １．２，Ｇｌｕｃｏｓｅ ｌｌ， 通心脉方由黄芪、川芎、血竭等药物组成，是上 海中医药大学严世芸教授在长期的医疗实践中总结 出的治疗冠心病的经验方，在临床上治疗冠心病疗 ｐＨ ７．４，持续充以９５％Ｏ：和５％ＣＯ ）恒温恒流 （３７ｏＣ，１２ ｍｌＹ分）灌流。用眼科剪在左心耳根部剪 一效显著。现代研究报道，予以黄芪及川芎提取物对 大鼠缺血再灌注心肌进行干预，能减少大鼠血清 ＣＫ、ＬＤＨ活性和ＭＤＡ含量，而ＳＯＤ及ＧＳＨ—Ｐｘ活 小口，将球囊通过左心耳插到左心室。向球囊内 注人生理盐水，平衡期调整ＬＶＥＤＰ于８—１０ ｍｍＨｇ 之间。导管连压力换能器，用４道生理信号记录分 析仪记录平衡期间、停灌期间、再灌注５、ｌ５、３０、４５ 及６０分钟时Ｉ ＤＰ、ＬＶＥＤＰ、ＣＰＰ、±ｄｐ／ｄｔｍａｘ数值 正常灌流组全过程用Ｋ—Ｈ液恒速持续灌流１２０分 性显著提高，改善心功能¨ ｊ。本研究观察ＴＸＭ对 大鼠心脏缺血再灌注损伤（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ，ＭＩＲＩ）的保护作用，为临床应用提 供理论依据 １材料与方法 钟，其余组心脏平衡ｌ０分钟后停灌５０分钟，再灌注 ６０分钟。收集再灌注５分钟时冠脉回流液做ＬＤＨ 含量测定。实验结束后取部分左室心肌液氮速冻后 于一８０℃冰箱保存，用于ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＭＤＡ含量测 定，部分心肌置于４％多聚甲醛固定，用于光镜形态 学检查。 １．１ 动物健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠４８只，体重（３００ ４－２０）ｇ，购于上海中医药大学实验动物中心，实验 动物合格证号：ＳＹＸＫ（沪）２００４—０００５。 １．２仪器ＭＬ１７６型Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆｆ离体心脏灌流装 置，ＭＬ７８５型生物信号处理和分析系统，ＭＬＴ１０５０ 型高精度压力换能器（澳大利亚）；Ａｄｖｅｎｔｕｒｅｒ Ｏｈａｕｓ ＡＲＩ １４０／Ｃ型电子分析天平（美国）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅ— ｖｉｃｅ ｓＰＥｃＴＥＲＡｍａｘ１９０酶标仪（美国）；ＢＲＡＮＳＯＮ 超声组织破碎仪（美国）。 ２．４统计分析所有数据均以均数±标准差（ｘ± ｓ）表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析，多 组间两两比较采用ｚ检验。所有资料用ＳＰＳＳ】７．０ 软件进行分析，Ｐ＜０．０５为差异显著性标准。 ３ 结果 １．３ 药品与试剂 ①通心脉方由黄芪、川芎、血竭 等５味药组成，经上海中药标准化中心鉴定后，由本 校中药研究所采用醇提法提取，全方得率２９．５７％， 用含０．５％甲基纤维素双蒸水配成０．５ ｇ／ｍＬ混悬 液。②卡维地洛：齐鲁制药有限公司，批号：国药准 字Ｈ２００００１００。③ＳＯＤ、ＭＤＡ、ＣＡＴ、ＬＤＨ试剂购于 南京建成生物工程研究所。 ２实验方法 ３．１ 心功能的变化ＴＸＭ及卡维地洛对大鼠离体 心脏ＩＲ心功能的影响见表１—６。 表１ 各组离体大鼠心脏ＣＰＰ水平对比（ ± ，Ｆｔ：８，ｍｍＨｇ） ｌ／￣，＇ｒｎＪ（ｔｌｍ￣）缺血再灌注纽 再灌注５ ６９ ７±５ ７５ 雨灌注１５ ７４ １±６ ３６ 再灌注３０ ８６ ８±９ ６８ 再灌注４５ ９８ ｌ±１０ ８６ 维地洛组ＴＸｂｌ太剂量封｛ＴＸＭ中荆鼠鲴Ｔ＇ＫＭ小刑鲢绒 ７１ ８ｊ】５ ２９ ７７ ０±１５憾 ８６ ０±１２ ９３ ９６ ６±１６ ３５ ５６．Ｉ±５螬※※ ５４ ５±８ ３８※※ ５３ ８±土３９※※ ６２ ５±８ ５１ ５８ ８±８ ９５※ ６３ ８±１４ ０９ ７３ ８±６ ６７ ８０ ６±７卵※７ｌ １±１０ ９８ ８２ ６±１２ １７ ７５ ５±Ｉｌ ６２ ８５ １±１３ ７６ 基堂些竺 ：： ！ ：翌 翌． ：！：箜 墅：！ ！．翌篓 苎．！ ：竺 ！ ．！ 注：与缺血再灌注组比较，※Ｐ＜Ｏ．０５，※※Ｐ＜０．０１ ． ２．１ 实验动物及分组将４８只体重（３００±２０）ｇ 表２各组离体大鼠心脏ＬＶＤＰ水平对比（Ｘ±ｓ，ｎ＝８，ｍｍＨｇ） ｌ时间 ）缺血再灌注组 维地洛组 ⅨＭ太刺 ｌ ｒｘＭ中蒯 ｛ＴＸＭ小刺鲢绑 的雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠随机分为以下６组：正常灌流组， 模型组，ＴＸＭ大、中、小剂量组，卡维地洛组，凡＝８。 ２．２给药方法参照文献 根据“人和动物按体 表面积折算的等效剂量比值表”折算，正常灌流组、 再灌注５ ｆ耳灌注１５ 冉藕注３０ 再灌注４５ ４ ３±２ Ｉ ４ ６±２ ６１ １０ ４±４ ２０ ４０ ６±１５ ４８※※ ３７ １±１６ ３２※※ ２９ Ｉ±ｌ１ ４５※※ ２８ １±１４ ６７※※ ４０１±加１６※ ３６ ８±Ｉ１ ８９※※２６ ３±１Ｉ位※※ ２４ ７±Ｉｌ ０４※ ５０ ３±２１ ６５※※５３ ３±１８∞※※３６ ８±１３ ４４※※ ２３ ４±７｛｝９※★ ５９ ２±ｌ７ ９３※※ ６２ ７±１９ ２６※※ ５５ ５±１７ｉｆ／※※２７ ｌ±１３ Ｉ１▲★｝ １６ ９±８ ８９ ！翌曼鎏竺 兰：！ ：！！ 堡： ！：垫堂篓坚：！ ！ ：箜 兰竺：： 竖： 登耋兰． ： ！： 模型组予以生理盐水１０ ｍＬ・（ｋｇ・ｄ） 灌胃；ＴＸＭ 大、中、小剂量组分别予以生药ｌ１．４、５．７及２．９ ｇ・ （ｋｇ・ｄ） 灌胃；卡维地洛组予以２ ｍｇ・（ｋｇ・ｄ） 灌 胃，连续ｌ５天。 注：与缺血再灌注组比较，※Ｐ＜０．０５，※※Ｐ＜０．Ｏ１；与卡维地 洛组比较，ＡＰ＜０．０５；与ＴＸＭ大剂量组比较，★Ｐ＜０．０５；与ＴＸＭ中 剂量组比较， Ｐ＜０．０５。 表３各组离体大鼠心脏ＬＶＥＤＰ水平对比（ ±ｓ，ｎ＝８，ｍｍＨｇ） ３ ８±２ ７９ ４ ０±１ ６９ ３３ｌ±１２ ８７※※２９ ８±８ ９４※蒜 ２５ ５±９∞※褒 恐０±８ ７８※※ ４ ７±２ ４３ ３６ ５±１２ ９８※※ ３３ ６±ｌＩ循※※２４ ４±７ ８９※※ ２３ ８±８ ３３※※ ６ ８±３ ５±１４ ２７※ ３７１±１２ ４６※※ ３２ ４±１２ ７９※ ２６ ８±１２ ０６※※ ３ｌ±ｌ Ｉ５ ｌ±１９ ６（）▲ ５７ ４±１９ ３１ ５３ ８±２４晒 ５ｏ ８±２１ ３３ ２．３造模方法参照文献 方法加以改进，大鼠 ６ｌ ７±９ ９８ ６ｌ ｌ±９ ６９ ５６ ２±９ ８ｌ ５４ ７±ｌｌ ５１ ５４ ５±Ｊ２∞ 末次给药后６０分钟造模，腹腔注射肝素１ ０００ ｕ／ｋｇ 抗凝，２０分钟后腹腔注射戊巴比妥钠５０ ｍｇ／ｋｇ麻 醉，开胸，取出心脏固定于Ｌａｎｇｅｎｄｏｆｆｆ装置上，用Ｋ —２０ ２±８ ２１※※ ２３ ２±７ ３６※※ ２７ Ｊ±ｌ２ ４４※※４９ ２±１７ ７５▲▲ 注：与缺血再灌注组比较，※Ｐ＜０．０５，※※Ｐ＜０．叭； 卡维地 Ｉ｛液（单位：ｍＭ，ＮａＣ１ １１８，ＫＣ１ ４．７，ＣａＣＩ １．２５， ・洛组比较，▲Ｐ＜０．０５，▲▲Ｐ＜０．Ｏ１。 ６４・ 江西中医药２０１１年６月第６期总４２卷第３４２期 表４各组离体大鼠心脏＋ｄｐ／ｄｔｍａｘ水平对比（元±ｓ，ｎ：８，ｍｍＨｇ） 注：与缺血再灌注组比较，※Ｐ＜Ｏ．０５，※※Ｐ＜Ｏ．０１；与卡维地洛组比较，ＡＰ＜０．０５，▲▲Ｐ＜０．０ｌ；与ＴＸＭ大剂量组比较，★Ｐ＜０．０５，★ ★Ｐ＜０．０１；与ＴＸＭ中剂量组比较，｝Ｐ＜０．０５，％ Ｐ＜０．Ｏｌ。 表５各组离体大鼠心脏一ｄｐ／ｄｔｍａｘ水平对比（ ±ｓ，ｎ＝８，ｍｍＨｇ） 注：与缺血再灌注组比较，※Ｐ＜Ｏ．０５，※※Ｐ＜０．０ｌ；与卡维地洛组比较，▲Ｐ＜０．０５，▲▲Ｐ＜０．０１；与ＴＸＭ大剂量组比较，★Ｐ＜０．０５，★ ★Ｐ＜０．叭；与ＴＸＭ中剂量组比较， Ｐ＜０．０５。 表６正常组大鼠离体缺血 再灌注心脏血流动力学比较（元±ｓ，ｎ＝８） “心悸”范畴。ＴｘＭ是严世芸教授在长期的医疗实 践中总结出的治疗冠心病的经验方，严教授对冠心 病的诊治重视调心脏的气血阴阳ｌ ，根据冠心病本 虚标实的病机特点，常治以益气温阳、通脉化瘀法。 本研究在离体心脏研究显示，ＭＩＲ后心肌组织中 ３．２ ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＭＤＡ及ＬＤＨ见表７。 表７通心脉方对各组大鼠离体心脏缺血 ＳＯＤ及ＣＡＴ活性降低，ＭＤＡ大量生成。，Ｄ（Ｍ可显 著升高心肌组织中ＳＯＤ及ＣＡＴ活性而降低ＭＤＡ 含量，降低冠脉回流液中ＬＤＨ的含量，显著改善心 功能，减轻心肌组织病理改变。结果提示，ＴＸＭ可 减轻大鼠缺血后心肌细胞脂质过氧化反应，增强心 肌抗氧化能力，减轻心肌缺血再灌注损伤。 参考文献 ［１］王伟，刘齐宁，赵新京．黄芪预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤 的保护作用及其机制［Ｊ］．西安交通大学学报（医学版），２００９， ３０（６）：７１２—７１５． 再灌注ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＭＤＡ及ＬＤＨ的影响（ｎ＝８， ±ｓ） 注：与ＩＲ组比较，※Ｐ＜０．０５，※※Ｐ＜０．０１。与正常濯沉组比 较△Ｐ＜０．０１。 ３．３病理组织学变化 正常组灌流组心肌细胞排 【２］ＺＨＯＵ Ｊ Ｙ，ＦＡＮ Ｙ，ＫＯＮＧ Ｊ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｓｏｌａ— ｔｅｄ ｆｒｏｍ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｒｎｂｒａｎａｃｅｕｓ Ｂｕｎｇｅ ｏｎ ｃａｒｄｉａｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｅｄ 列整齐，结构清楚，未见心肌细胞溶解、断裂。ＩＲ组 心肌纤维排列紊乱，可见心肌细胞肿胀、断裂。ＴＸＭ 大剂量组及卡维地洛组偶见心肌细胞溶解，肌丝结 ｂｙ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｅｈｅｍｉｃ—ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ Ｃｈｉｎ Ｍａｔ Ｍｅｄ （中国中药杂志），２０００，２５（５）：３００—３０２． ［３］张群峰，陈连剑，黎敏．川芎嗪对大鼠心脏缺血一再灌注损伤的 保护作用［Ｊ］．中国医药导报，２００９，６（９）：１７～１８． ［４］徐叔云，卞如濂，陈修．药理实验方法学．第３版［Ｍ］．北京：人 民卫生出版社，２００２：２０３． ［５］Ｋｈａｎ Ｍ，Ｍｏｈａｎ Ｌ ｋ，Ｋｕｍａｒ Ｖ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｕｌｆａ— ｐｈｅｎａｚｏｌｅ，ａ ｃｙｔｏｅｈｒｏｍｅ ｐ４５０ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉａ— 构基本完整，少部分断裂，与ＩＲ组相比损伤程度明 显减轻。ＴＸＭ中、小剂量组与ＩＲ组形态学上无明 显差异。 ４讨论 ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］ ．对ＭＩＲＩ的机制认识逐渐明了，越来越多的证 据显示ＭＩＲ时氧自由基生成过多、钙超载、白细胞 的大量激活及能量代谢障碍等在ＭＩＲＩ中起重要的 作用 Ｊ。中医学中无ＭＩＲＩ这一病名，但根据其病 变部位（心）和临床表现（主要为胸痛、胸闷、短气、 疲乏无力、心律失常等），应属于“胸痹”、“心痛”、 ・ＪＰＥＴ，２００７，３２３：８１３—８２１． ［６］海春旭．自由基医学［Ｍ］．西安：第四军医出版社，２００６：６５— ６６． ［７］徐燕，蒋梅先，唐靖一，等．严世芸论治心病的经验［Ｊ］．上海中 医药杂志，２００５，３９（９）：７—８． （收稿日期：２０１１＿ｏ３＿ｏ３责任编辑：曾文雪） ６５・