EDC交联的明胶微球支架制备及其生物相容性研究

陆伟;俞洁;郭红丽;马辰春;金岩;冀堃

【摘 要】目的 制备EDC交联的明胶微球作为支架材料,并对其生物相容性进行评价,为构建工程化的脂肪组织奠定基础.方法 制备明胶微球,并利用5 mmol EDC对其进行交联,获得75～ 150 μm粒径大小的微球;扫描电镜观察,检测微球的细胞相容性和组织相容性.结果 经EDC交联的明胶微球均呈圆球体,大小比较均匀,粒径75～150 μm,细胞毒性等级为0～Ⅰ级;将微球植入SD大鼠皮下,植入部位未见明显红肿,伤口无红肿、渗液等炎性反应,组织学观察植入明胶微球局部无明显炎症细胞浸润,静态培养时脂肪组织来源干细胞(ADSCs)在微球上生长状态良好.结论 EDC交联的明胶微球是一种具有较好的细胞亲和性、生物相容性和生物可降解性的天然高分子支架材料,以脂肪组织来源干细胞为种子细胞,可以为临床使用提供一种工程化脂肪组织填充物.

【期刊名称】《北华大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2014(015)001

【总页数】5页(P49-53)

【关键词】碳化二亚胺;明胶微球;生物相容性;脂肪组织来源干细胞;组织工程脂肪

【作 者】陆伟;俞洁;郭红丽;马辰春;金岩;冀堃

【作者单位】解放军第208医院461临床部口腔中心,吉林长春130021;解放军乌鲁木齐总医院,新疆乌鲁木齐830000;解放军第208医院461临床部口腔中心,吉林长春130021;解放军第208医院461临床部口腔中心,吉林长春130021;第四军医大学组织工程中心,陕西西安710032;解放军第208医院461临床部口腔中心,吉林长春130021;第四军医大学组织工程中心,陕西西安710032

【正文语种】中 文

【中图分类】R749.16

创伤、感染、先天畸形和肿瘤切除术后常导致软组织缺损，需要进行修复重建．目前临床上软组织修复重建常用的方法包括自体组织移植和人工合成充填物植入．利用自体脂肪组织移植修复软组织缺损脂肪成活率低，且容易液化吸收，移植后易变形，效果并不理想［1－2］．随着组织工程学技术的发展，构建工程化的脂肪组织已成为组织工程研究领域的热点之一．明胶(Gelatin)是胶原蛋白部分降解的产物，分为A型和B型两类．明胶中主要成分是蛋白质，包括18种氨基酸成分，其中7种为人体所必需，其理化性能可依据某些官能团的存在而调整．明胶还具有抗原性、价格低廉、体内自然降解等优点，是组织工程支架材料制备的一种理想来源．由于明胶具备优良的理化特性和生物相容性，是一种制备微球的优质材料，所以，利用明胶制备明胶微球，可以为工程化脂肪组织的制备提供合适的生长环境．脂肪组织来源干细胞(ADSCs)是一类具有自我更新与增殖分化能力的细胞，是工程化脂肪种子细胞来源的理想选择．

本研究采用乳化法制备微球，该方法操作简单，条件温和，也是生物、医药等领域中

研制明胶微球最常用的方法．但由于明胶本身具有高亲水性和脆性，为了扩展其在组织工程领域中的应用，在制备过程中需要对明胶进行交联．目前的交联方法有化学交联、物理交联和光交联，化学交联是最稳定的方法．戊二醛是常用的化学交联剂，但戊二醛交联产物因生物降解释放到宿主体内是有毒的，这需要我们找到一种新的交联剂，它不仅能使形成的明胶微球具有稳定特性，更要具备很好的生物相容性．本研究中采用的交联剂是碳化二亚胺(1－Ethyl－3－(3－dimethylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride，EDC)，EDC交联剂只是帮助明胶分子中的羧基和氨基之间形成酰胺键［3］，而本身并没有成为实际交联的一部分，具有无毒、生物相容性良好的特点［4］．本文通过观察制备明胶微球的性状和生物相容性，以及脂肪组织来源干细胞(ADSCs)与其黏附生长的情况，为下一步构建工程化脂肪组织奠定基础．

1．1 试剂与仪器

EDC(Sigma公司)，明胶(分子量99 000 Da，等电点5．0，Sigma 公司)，Span－80(Sigma 公司)为进口分析纯;无水乙醚、丙酮、异丙醇、液状石蜡、氨基己酸为国产分析纯，水为双蒸水;胰蛋白酶、胶原酶(Sigma公司);DMEM培养液、DF12培养液和FBS(Gibco公司);JJ－1型精确电子搅拌器、真空干燥箱、Leica激光共聚焦显微镜、HITACHI S－2700扫描电子显微镜、GENESIS冻干机(Virtis公司)．

1．2 明胶微球的制备

将称取的1．5 g明胶(淡黄色粉末)溶于10 mL纯水中;将石蜡55 mL置于三口瓶中预热至55℃，快速搅拌(300 r/min);再加入0．6 mL 1%span(斯盘)80;再缓慢滴加同样

温度的明胶水溶液，继续搅拌15 min，形成水包油乳剂后，迅速改冰浴，继续搅拌30 min;加入30 mL丙酮继续搅拌30 min;加入5 mmol EDC交联剂，搅拌下预固化2 h;将混有明胶微球的液体转入烧杯中，4℃静置2．5 h固化;吸出上清，加入丙酮，清洗沉淀下来的微球;继续吸出上清，加入丙酮、石油醚交替清洗(至少3次)，最后用丙酮洗涤;使用0．1 mol/L甘氨酸清洗(3．75 g配500 mL纯水)，最后用纯水洗干净，转移到培养皿中，水尽量吸干，低温真空干燥，通过筛网获得75～150 μm粒径大小的微球;60Co照射灭菌封存．

1．3 微球的形态学观察

将无菌微球干粉先用培养液浸泡24 h后取样，在倒置相差显微镜或干燥喷金后扫描电子显微镜下观察．

1．4 细胞毒性试验 (MTT法)

无菌微球干粉称重放入无菌试管，加入含10%小牛血清的DMEM培养液，置于37℃培养箱中培养72 h，制备出材料浸提液，样品浸提液量为0．2 g样品/mL;再分别加入培养液稀释，使试验组样品浸提液最终浓度为原浸提液浓度的75%，50%，25%，其中50%组为标准组．空白为阴性对照组，即正常的培养液(10%小牛血清的DMEM培养液)，阳性对照为0．64%苯酚．将建系的L929小鼠成纤维细胞(第四军医大学组织工程中心提供)用培养液制备成浓度为1 000细胞/mL的细胞悬液，加入96孔塑料培养板(每孔200 μL)，培养24 h，以使细胞贴壁．24 h后舍弃原培养液，空白对照组用新鲜培养液置换，试验组分别用25%，50%，75%，100%浓度的浸提液置换，然后放入培养箱中培养．按4

个时间点(1，3，5，7 d)共种4块96板，放入培养箱(37℃、饱和湿度、5%CO2)中继续培养，每个实验组6孔．于培养后1，3，5，7 d各取1块培养板，在倒置相差显微镜下观察活细胞形态，每孔加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h，再置于倒置相差显微镜下观察结晶物密度．吸除孔内液体，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，室温下振荡器振荡10 min，使结晶物充分溶解，然后在酶联免疫检测仪(I型，南京华东电子仪器厂)上以490 nm波长测定各孔光吸收值(OD值)．通过下式计算细胞相对增殖率(relative growth rate，RGR):

各浓度组RGR对应为0～Ⅳ级材料毒性等级具体见表1．统计分析采用t检验，进行均数间两两比较．

1．5 组织相容性试验

SD大鼠12只，雄性，体质量300 g，每组4只．戊巴比妥钠腹腔麻醉，背部皮肤脱毛处理，75%酒精消毒皮肤，背部正中切开0．5 cm长小口深至深筋膜，向切口两侧止血钳钝性分离约2 cm．将适量微球埋藏在皮下，缝合切口，消毒创面，分笼饲养．在术后1，2，4周定时观察切口及微粒埋藏部位组织有无红肿、感染，并取出皮下移植的微球及周围组织，H＆E染色观察．

1．6 人脂肪组织来源干细胞的培养

获取人腹部成形术的健康个体皮下脂肪组织，并经患者知情同意，医院伦理委员会批准．首先去除大的血管、腺体以及筋膜组织，PBS洗涤后，将脂肪组织剪碎，使用625

U/mL的Ⅰ型胶原酶37℃消化80 min;再加入两倍体积的PBS液，轻轻吹打，使细胞充分从组织团块上脱离下来，74 μm的筛网过滤后，将形成的单细胞悬液800 r/min离心5 min;倾去上层脂肪和上清液，再加入PBS液重悬细胞再次离心;加入培养液为含 150 mL/L FBS，10 ng/mL碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，100 U/mL 青霉素，100 μg/mL链霉素，2 mmol谷氨酰胺的 DMEM/F12;以1×104个/mL细胞密度接种到75 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养，原代培养第2天换液去除未贴壁细胞，待克隆细胞长满80%时用胰酶－EDTA消化传代培养;以5 000个/cm2密度传代，传代时培养基为100 mL/L FBS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL 链霉素，1 mmol谷氨酰胺的DMEM，取第3～4代的细胞使用．

1．7 ADSC在微球的黏附与生长情况

将无菌微球干粉先用培养液浸泡24 h后，将人脂肪组织来源干细胞接种在微球上，静态培养3 d，取样，在倒置相差显微镜或干燥喷金后扫描电子显微镜下观察．

2．1 明胶微球的形态学观察

光镜下，明胶微球成圆球体，可透过一部分光线，大小较均匀(见图1A);高倍镜下观察明胶微球浸泡培养液后表面光滑(见图1B);扫描电子显微镜观察，所制备的微球均呈圆球体，大小比较均匀，粒径在75～150 μm，干燥状态的微球表面光滑，只有少许颗粒状吸附物，但未见微孔和裂纹(见图1C)．

2．2 细胞毒性试验

随着培养时间的增加，所测材料各浓度组的吸光值也相应增加，低浓度组的吸光值与高浓度组相差不明显．1，3，5，7 d时间各浓度组和空白对照组的OD值如表2所示．参照表1计算出实验组不同浓度的细胞毒性级别为Ⅰ级，接近0级，而阳性对照(0．64%苯酚)的细胞毒性为Ⅳ级，表明EDC交联的明胶微球无明显细胞毒性．

2．3 明胶微球的组织相容性

经EDC交联的明胶微球植入大鼠皮下后，植入部位未见明显红肿，伤口无红肿、渗液等炎性反应．术后1周，在明胶微球的周围未见到明显的急性炎症反应，周围组织包绕明胶微球，但与部分明胶微球之间有一定的间隙(见图2A，B);术后2周(见图2C，D)，4 周(见图2E，F)时，在明胶微球的周围也未见到炎性细胞，微球降解不明显，与皮下组织的整合较好，EDC交联的明胶微球的组织相容性良好．

2．4 明胶微球的细胞相容性

接种hADSCs的明胶微球，在微球表面有大量细胞的吸附，但由于是静态培养，细胞在微球表面吸附不均匀(见图3A)．扫描电子显微镜观察，吸附的细胞微绒毛清晰，细胞状态好(见图3B)．

创伤、先天性缺陷和肿瘤切除术常导致软组织缺损，需要通过手术进行修复重建，而其中大部分软组织缺损是由于脂肪组织缺失而导致正常组织形态改变和功能障碍．为了满足功能性恢复和美观的需求，对于一些深部的软组织缺损需要进行脂肪充填塑型．但由于直接进行自体脂肪组织移植时常造成供体部的畸形，而且移植的脂肪组织常常发生液化吸

收而改变形态［1－2］．随着组织工程学技术的发展，构建工程化的脂肪组织已成为组织工程研究领域的热点之一．工程化的脂肪组织核心是优化选择种子细胞和细胞外基质．

微球是由有机聚合物或无机聚合物组成的，直径20 nm～2 000 μm，或者是更大的球形粒子．微球是一类均相分散体系，整个球体的成分是均匀的．用于制备微球的天然高分子主要有蛋白类(明胶、丝素蛋白、白蛋白等)和多糖类(阿拉伯胶、壳聚糖、海藻酸盐、淀粉、琼脂等)，其特点是稳定、无毒，成球性、生物相容性和生物可降解性好，且降解产物无毒副作用．由于明胶廉价易得，本实验选用明胶作为微球的制备材料，明胶微球可以作为细胞的生长载体、细胞因子的释放载体用于组织再生的治疗［5］．

明胶是动物胶原经水解而提炼出来的，是肽类与氨基酸交联形成的直链聚合物，由18种氨基酸和肽形成的天然高分子生物材料，在水中久浸可吸水膨胀或软化，无抗原性，机体内组织相容性好，在体内可自然降解并被组织吸收替代．未经交联的明胶微球容易被组织中蛋白酶水解，从而导致降解时间过短，不利于缺损组织的组织工程构建．经交联的明胶微球抗蛋白酶降解能力显著增强，体内降解速度变缓［6］，交联可以延缓明胶在缺损组织移植部位的降解．化学交联是明胶微球常用的交联方法，目前最常用的交联剂是戊二醛．戊二醛交联简便高效，可使明胶发生分子内和分子间双重交联，交联密度高．戊二醛交联缺点是醛类物质在明胶微球内残留不易除尽，不利于在组织修复中使用．本实验采用EDC交联剂，EDC可促使胶原蛋白发生交联，通过与明胶中冬氨酸和谷氨酸残基上的羧基进行反应，但其本身并不进入明胶微球，而是转变成水溶性的脲衍生物排出．明胶微球制备可通过改变明胶溶液浓度、搅拌子转速等调节明胶微球的粒径，通过改变交联剂浓度调节交联程度，最终影响其作为支架材料在体内的降解速度．本实验制备的微球大小较均一，参考国家标准GB/T16886《医疗器械生物学评价》对其生物相容性进行评价，本

实验制备的明胶微球具有很好的细胞相容性和组织相容性．

脂肪组织来源干细胞由于存在于脂肪组织内，为脂肪组织自我更新和脂肪代谢保持着一种动态平衡，而且其具有多向分化的能力，是工程化脂肪组织的理想种子细胞来源．本实验中使用的脂肪组织来源干细胞具有自我更新和向脂肪、骨、软骨分化的多向分化潜能［7－8］．明胶作为一种天然高分子材料，具有优良的生物学性能，在组织工程领域使用非常广泛［9］．明胶微球在组织工程脂肪的构建［10－11］应用中，一般只作为生长因子的控释载体，而本实验将明胶微球作为脂肪组织来源干细胞的生长载体，由于明胶材料可以降解，其可以携带大量的脂肪组织来源干细胞进入体内．明胶微球可作为细胞生长的依附和支持物，具有促进细胞黏附和生长的性能，结合脂肪组织来源干细胞和定向诱导分化技术，可作为工程化脂肪制备的支架材料．

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Tissue