死细胞,细胞碎片会对RNA的纯度产生影响吗
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死细胞，细胞碎片会对RNA的纯度产生影响
从组织中用TRIZOL提RNA时组织的量并不是越多越好，在一定范围内是正好相反。我曾经做过对比，同一块组织经匀浆后做一定稀释，分别取50、100、150、200ul匀浆液提RNA做反转录PCR，除了组织的量不同外其它条件都一致，结果只有50ul的样品扩出了所需要的目的片段，经克隆测序验证正确。
提RNA的关键是Trizol的量要足，一般是10*6~10*7细胞加1ml Trizol，细胞数太多，Trizol的量相对就不足，裂解不完全，影响RNA的质量。一定要充分吹打混匀直至溶液澄清！！这时可以加氯仿往下做，也可以放在－20℃下冻存起来，到需要时再往下做，我放过一个多月再提RNA还是好的。另外加氯仿后要充分振荡混匀呈乳状，然后在室温下静置3~5分钟再去低温离心，分层都很明显，一般都有500~600μl的水相。后面的步骤就是沉淀、洗涤的过程了，最后用DEPC水溶解，按照程序来就ok了！加入异丙醇后也要在室温下静置10分钟再去离心比较好，也有的说在－20℃下静置
纯度与组织或是细胞的量确实相关,不过前提是TRIZOL加的量少;
如果加与组织或细胞相适应的TRIZOL量就可以充*解,去除蛋白了
1 TRIZOL去蛋白水平不行; 可是以前还好啊,TRIZOL是前三个月前订的,应该不会失效这么快.
2 TRIZOL未充*解,加入TRIZOL后我就用*吹打数次, 然后间断振荡, 不知大家怎么做的?到底该怎么让其充*解呢? 要是提组织RNA呢?怎么让TRIZOL充*解组织呢?
3 氯仿去蛋白水平不行; 可是以前还好啊,氯仿作为萃取溶剂,应该不存在污染失效的问题吧.
4 氯仿未充分与裂解液作用, 可是我剧烈振摇30秒,应该可以了吧?
5 加入氯仿静置时间短,导致分层不明显:同样10管,我都放了15分钟,有一管分层明显,就能够说明时间够了;
6 加入的组织过多?导致TRIZOL不能完全消化?我一般加入的组织是黄豆大小,加1毫升TRIZOL裂解,研磨消化完全后,加入氯仿
